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学习必备 欢迎下载 血红蛋白的提取与分离 （第一课时） 学习目标 1、理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用； 2、掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。 学习重点 凝胶色谱法的原理和方法。 学习难点： 1、样品的预处理； 2、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 小组合作、自主探究 【思考】 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 【基础知识】 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛选作 用，来分离蛋白质的有效方法。 2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋白质容 易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ， 而 的蛋白质无法进入凝胶内 部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速 ， 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3、具体过程： （1） （2） （3） （4） （5） 相对分子质量 较小的蛋白质 凝 胶 颗 粒 相对分子质量 较大的蛋白质 多 孔 板 A B A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。 B.（1） 混合物上柱； （2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒 内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外； 学习必备 欢迎下载 （3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。 （4） 不同的蛋白质分子完全分开； （5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的 蛋白质还在行进中。 ㈡ 缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液?PH?发生明显 变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用：能够抵制 的对溶液的 的影响， 维持?PH?基本不变。 3、缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以 制得 使用的缓冲液。 思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的?PH?环境，保证血红蛋白的正常 结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） ㈢电泳： 1、概念：指 发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如 等都具 有 在 下，这些基团会 带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其 移动。电泳利用了待分离样品中 各种分子 以及分子本身 、 的 不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。 3、分类： 电泳 电泳。 阴测定（?蛋白质相对分子质量?）通常用十二烷 阴 基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取 决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等 因素。 极 带电性质、分子大小和形状的 加入待分离的?????不同，使分子迁移速度不同 样品 阳极 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在 凝胶中加入 。 溶 液 SDS?能使蛋白质发生完全变性。由几条?肽链组 槽 琼 成的蛋白质复合体在?SDS?的作用下会解聚成单 脂 胶 条?肽?链?，?因?此?测?定?的?结?果?只 分子向阳极移动 缓冲液 是 。 凝胶电泳原理示意图 SDS?能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS?复合物，SDS?所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子 原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决 于 。 学习必备 欢迎下载 血红蛋白的提取与分离 （第二课时） 学习目标 1、理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用； 2、掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。 学习重点 凝胶色谱法的原理和方法。 学习难点： 1、样品的预处理； 2、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 小组合作、自主探究 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的：去除 ②方法： 离心，然后用胶头吸管吸出上层透明 的 ，将下层 的红细胞液体倒入 再加入 质量分数为 0.9?％的氯化钠溶液，缓慢搅拌 10min,?离心低速短时间离心。重复洗涤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分 离纯化，不可洗涤次数过少。 思考：洗涤次数为什么不能过少？离心速度和时间为什么不能过高和过长？ (2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加 到 体积， 再加?40％体积的 （溶解细胞膜）?，置于 上充分搅拌 10?分钟（加速细胞破裂）,?细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好混合液转移到离心管内，以?2000r/min?的速度离心?10?m