微生物发酵技术 任务五 抗生素微生物检定法 抗生素微生物检定法.ppt

主要是吸潮和防止细菌蔓延的作用，厚薄一致，表面光滑、平坦，吸水性强。不需要洗涤，140℃干烤1h消毒、降温后拿出。 陶瓦盖 （1）菌悬液的制备 按照抗生素检定实验设计表选择相应的试验菌，培养制备菌悬液。 抗生素类别 试验菌 培养基 灭菌缓冲 液PH值 抗生素浓度范围 （单位/ml） 培养条件 编号 PH值 温度/℃ 时间/小时 链霉素 枯草芽孢杆菌 [CMCCB（B）63 501 Ⅰ 7.8～8.0 7.8 0.6～1.6 35～37 14～16 卡那霉素 枯草芽孢杆菌 [CMCCB（B）63 501 Ⅰ 7.8～8.0 7.8 0.9～4.5 35～37 14～16 巴龙霉素 枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63 501] Ⅰ 7.8～8.0 7.8 0.9～4.5 35～37 14～16 妥布霉素 枯草芽孢杆菌 [CMCCB（B）63 501 Ⅰ 7.8～8.0 7.8 1～4 35～37 14～16 罗红霉素 枯草芽孢杆菌 [CMCCB（B）63 501 Ⅱ 7.8～8.0 7.8 5～10 35～37 16～18 庆大霉素 短小芽孢杆菌 [CMCC（B）63 202] Ⅰ 7.8～8.0 7.8 2.0～12.0 35～37 14～16 （2）供试品、标准品溶液的制备 标准品溶液的制备：标准品的使用与保存，应遵循标准品使用说明书的规定。从冰箱中取出标准品，于室温平衡后，以减量法精密称取不少于20mg、一般为50mg的标准品，根据标准品的标示效价单位加入稀释液，制成浓度一般为1000U/ml的浓溶液，贮存于冰箱中备用。 临用时依据抗生素微生物检定实验设计表的规定，取标准品1000U/ml的浓溶液，用缓冲液稀释成滴碟所用高、低两浓度，作为标准品溶液。 标准品和供试品高、低浓度的剂量比一般为2:1，当高、低剂量所致的抑菌圈直径差别较小时，可用高、低剂量之比为4:1的比率 （3）双碟的制备 底层：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固，更换干燥的陶瓦盖。 菌层的制备 在培养基中添加一定量的菌悬液，振摇混匀。注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量。 每只双碟加入5ml菌层培养基。 注意制备菌层的速度和平整度。 （4）放置钢管 在每只双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管4个（二剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。 注意使钢管平稳落在培养基上，各个钢管下落的高度应一致。 钢管放妥后，使双碟静置10min，钢管在培养基内稍下沉稳定。 （5）滴碟、培养 每批供试品双碟不少于4个，一般取4～10个 在每个双碟的4个钢管中，对角的两个钢管分别滴加高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个对角位置的钢管分别滴加相应的高、低浓度的供试品溶液。 按SH→TH→SL→TL顺序，分别滴加标准品和供试品高、低剂量溶液。 双碟的培养 根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜。 培养后的双碟 （6）抑菌圈的测量 将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不圆整圈应将碟弃去。 抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。 手工测量：游标卡尺 测量 抗生素微生物效价检定操作流程图 2.二剂量法的效价计算 P为供试品效价相当于标示值或估计效价的百分数； S2为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和； S1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和； T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和； T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；I为高、低剂量之比的对数（常数），高、低剂量之比为2:1时，I=0.301；高、低剂量之比为4:1时，I=0.602； PT：供试品的测得效价，U/mg； AT是供试品的标示（估计）效价，U/mg。 例3-1 某批红霉素效价测定，试验菌为短小芽孢杆菌（63202），标准品ds1为5U/ml，ds2为10U/ml，供试品dT1、dT2约与标准品溶液的浓度相当，供试品的估计效价AT为924.7U/mg，计算供试品的实际效价。 双碟号 ds1（5U/ml）/mm ds2（10U/ml）/mm dT1（5U/ml）/mm dT2（10U/ml）/mm 1 20.00 23.47 20.01 23.31 2 19.46 22.87 19.83 22.75 3 20.08 23.32 20.07 23.27 4 19.88 23.45 20.27 23.60 5 20.29 23.48 19.95 23.50 6 19.89 23.54 20.37 23.43 ∑y(k)/mm S1=119