利用CRISPR_Cas9技术编辑Pi21和D3基因改良水稻抗性和株型的研究.pdfVIP

摘要 我国作为人口大国，确保粮食产量稳定是关系国计民生的重要问题。针对有限的土 地资源，培育多抗、高产、优质的品种是确保粮食安全的根本途径。杂交育种等传统方 法由于具有分子机理不清、针对性较差及选育周期较长等问题，已经逐渐难以适应日益 提高的育种目标，而CRISPR/Cas9 技术通过编辑植物内源基因来改良抗性、提高产量， 具有高效、精准的特点。YH208 （宜恢208 ，籼稻）具有产量高、米质好等优点，但易 感稻瘟病，而携带隐性抗性的Pi21 等位基因对10 株稻瘟病生理小种具有抗性。DS （粳 稻）具有耐寒、米质优等特点，但其株高过高、易倒伏、分蘖少，而据报道D3 基因负 调控分蘖和株高。为此，我们利用CRISPR/Cas9 技术对YH208 的Pi21 和DS 的D3 基 因进行编辑以期改良其抗性或株型；同时为进一步探究Pi21 、D3 的作用机制以及水稻 遗传改良提供材料基础。结果如下： 1、利用CRISPR/Cas9 编辑Pi21 基因改良YH208 的抗性，前期我们筛选到一份高感穗 颈瘟的恢复系YH208 （宜恢208 ），将其与Pi21 感病等位基因进行比对分析，发现在其 238-247 、454-468 处有1bp 的置换（C 替换成T ）以及9bp、15bp 的缺失，与已报道的 感病基因型都不同，因此我们推测其可能为一个新的感病等位基因。在其 Pi21 的第二 个外显子上设计双靶位点，通过遗传转化及筛选获得了 10 株阳性植株，将其分为3 种 突变类型：1 种纯合突变，2 种杂合双等位突变。进一步从T1 代中筛选获得20 株不含 转基因成分的pi21 突变体； 2 、通过田间观察发现，pi21 突变体苗期植株表现矮小，营养生长发育迟缓，从两叶一 心时期从下部老叶边缘开始出现类病斑，但到花期类病斑表型则完全消失。经台盼蓝、 DAB 染色试验，结果表明pi21 突变体叶片出现大量的过氧化氢累积及细胞死亡。进一 步通过qRT-PCR 检测发现，突变体的防御相关基因PR1a 、PR10b 及SA、JA、ETH 通 路相关基因 WRKY45、LOX2 、EIN2 上调表达，表明pi21 突变体中的防御反应和SA、 JA、ETH 表达显著增强； 3、将 YH208 离体划伤接种 46 份单孢菌株，筛选到 7 个亲和菌株。从中选择 TJ13、 DZ108 对温室和田间环境中培养的pi21 突变体进行稻瘟病抗性接种，结果表明产生类 病斑的pi21 突变体增强了对稻瘟病的抗性，同时我们也对产生类病斑的pi21 突变体分 I 别进行白叶枯和纹枯病抗性鉴定，结果表明pi21 突变体易感纹枯病，但不影响对白叶枯 的抗性； 4 、通过对pi21 突变体主要农艺性状的统计分析，表明pi21 突变体相比野生型其米质、 分蘖数和每穗实粒数不受影响，但株高、结实率受到一定影响，尤其产量上明显低于野 生型； 5、利用CRISPR/Cas9 编辑D3 基因改良DS 的株型，首先将DS （粳稻）与日本晴中负 调控分蘖的D3 基因进行序列比对，发现序列完全一样，表明DS 中的D3 基因同样负调 控分蘖。在DS 的D3 基因外显子前端设计单个靶位点进行基因编辑，从T1 代中共获得 了4 种类型的纯合突变体，均为碱基缺失，其中d3KO#1 仅缺失3bp，没有产生移码突 变。进一步从T2 代中筛选到51 株不含转基因成分d3 突变体； 6、田间叶龄统计发现，d3 突变体生育期相比野生型缩短 1 周。通过连续两代的考察发 现T1 代纯合株系的农艺性状能够稳定遗传到子代，除d3KO#1 株系农艺性状相比野生 型没有明显差异外，其他3 个株系株高变矮、分蘖增多，但穗长变短、每穗实粒数变少， 导致最终产量没有差异； 7、对d3 突变体接种稻瘟菌、白叶枯菌和纹枯菌，结果表明d3 突变体相比野生型增强 了对白叶枯的抗性，但易感纹枯病和稻瘟病。与野生型相比，d3 突变体在接种稻瘟菌后 其防御相关基因表达显著下调，稻瘟菌侵入位点过氧化氢累积减少； 以上结果表明：利用CRISPR/Cas9 技术编辑YH208 的Pi21 和DS 的D3 基因，pi 21 突变体产生类