水稻花粉发育基因LSP2的克隆及功能研究.pdfVIP

摘要 水稻 （Oryzasativa）作为世界上最重要的粮食作物之一，全世界超过50% 的人口以之为主食，因此不断提高水稻的产量意义重大。杂交水稻的推广，为人 类粮食的增产做出了巨大贡献。在水稻雄性生殖发育过程中，花药和花粉的发育 扮演着十分重要的角色，而花粉壁对花粉而言具有特殊作用，一方面可以保护雄 配子免受各种环境胁迫和病原体攻击，另外也具有促进花粉萌发的功能。因此， 正常的花粉壁建成是功能花粉形成所必需的。近年来，水稻花粉发育机制取得了 大量进展，但相比拟南芥仍存在一定差距。 雄性不育突变体是研究花粉发育的材料基础。因此，为了增进对水稻花粉发 育的了解，本实验通过筛选EMS诱导的籼稻品种9311突变体库，获得了一份新 的雄性不育突变体材料。通过遗传学、分子生物学和细胞学等实验手段，成功克 隆了该雄性育性控制基因，并初步验证了其功能。主要结果如下: 1. 突变体鉴定。与野生型9311相比，突变体表现正常的营养生长、花序和 花形态，但突变体花药更小且颜色更浅。I -KI 染色液进一步染色发现突变体花 2 粉粒变少、变形、皱缩，且基本不着色。据此，将突变体命名为lsp2 （Lessand shrunkenpollen 2)。遗传分析显示该突变性状受一对隐性基因控制。 2. 细胞学鉴定。花药半薄切片结果显示，突变体在花药发育的第8期开始 出现缺陷，表现为绒毡层细胞肿胀，降解紊乱；进一步扫描电镜和透射电镜观察 发现，突变体花药绒毡层中的乌氏体发育异常，花粉外壁异常。 3. 基因定位。通过构建突变体基因组混池并利用MutMap 技术筛选与不育 表型关联的SNP，我们发现2 号染色体上一个SNP （G 变成A）位点与突变性 状紧密连锁，这个SNP 位点位于预测基因的第四个外显子上。进一步共分离实 验证实该SNP 所在基因为目标性状的候选基因。 4. 候选基因功能验证。利用CRISPR/Cas9对该候选基因进行编辑，发现所 有功能缺失的突变体 （日本晴背景）都表现为雄性不育，且与突变体lsp2 的不 育缺陷基本一致。进一步回交构建分离群体，共分离分析证实该基因就是LSP2， 表明LSP2 是控制水稻雄性育性关键基因。 I 5. 组织表达模式分析。定量PCR 和GUS组织化学染色实验结果共同显示， LSP2 在根、幼穗和花药中高表达，在雌蕊、茎、叶和内外稃中几乎不表达；进 一步花药切片证实LSP2 主要在绒毡层中特异表达。 6. 亚细胞定位。通过烟草瞬时表达实验，发现LSP2 可能定位在膜上。进 一步将2×35S::LSP2::GFP 载体质粒与膜标记br356 通过农杆菌介导渗入在烟草 （Nicotiana benthamiana）叶表皮细胞中单独表达或共表达，发现LSP2 主要定 位在细胞膜上。 7. 相关基因表达差异。定量PCR 结果显示，在lsp2 中，OsPKS2 和TDR 的表达无显著变化，但CYP704B2、DPW、OsACOS12 和OsNP1 的表达水平显 著低于野生型，表明LSP2 控制花粉发育的生化途径可能与CYP704B2、DPW、 OsACOS12 和OsNP1具有相关性。 关键词：水稻；LSP2；雄性不育；花粉；花粉外壁 II Abstract Rice (Oryza sativa) is one of the most important food crops in the world, and feeds 50% of the world’s population. It is of great significance to continuously increase the yield of rice. The application of hybrid rice breeding, which is based on the efficient use of male-sterile germplasms, has made great contributions to the increaseofriceyieldsforhuman