《miRNA及其发展和应用》.pptVIP

miRNA及其发展和应用 RNA在生命过程中的作用 mRNA——合成蛋白质的蓝图 rRNA——合成蛋白质的工厂 tRNA——合成蛋白质的搬运工 miRNA——？？？ 被关注的RNA研究 2000年，RNAi的研究进展被Science杂志评为重大科技突破。 2001年，RNAi作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”。 2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。 2003年，microRNA的研究第四次入选“十大科技突破”。 2005年，microRNA的研究第五次入选“十大科技突破”。 2006年，RNAi获得当年的诺贝尔生理学或医学奖。并且microRNA的研究第六次入选“十大科技突破”。 RNA研究的突破性进展，是生物医学研究领域近20年来，可与HGP相提并论的最重大成果之一。 什么是miRNA miRNA的发现 miRNA的产生过程 miRNA的作用机制 miRNA的特点 与其他寡核苷酸相比,主要有三点不同: 没有开放阅读框架及蛋白质编码基因的特点 通常的长度约为22个核苷酸,但在3’端可以有几个碱基的长度变化 成熟的miRNA5’端有一磷酸基团,3’端为羟基 miRNA的生物学功能 miRNA的保守性 miRNA 靶基因的寻找 尽管数百种miRNA在最近几年中被发现了,但是只有非常少量的miRNA被确定其作用,许多其他的miRNA基因的作用还没有被阐明。因此发现miRNA的作用靶点成为了解其在不同的生理过程中的功能的关键。 目前主要利用生物信息学方法和生物学实验方法寻找 miRNA 的靶基因。 生物信息学方法寻找miRNA 靶基因 生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选。 主要遵循以下几个常用原则: miRNA 与其靶位点的互补性 miRNA 靶位点在不同物种之间的保守性 miRNA-mRNA 双链之间的热稳定性 miRNA 靶位点处不应有复 杂二级结构 miRNA 5′端与靶基因的结合能力强于 3′端 常用的算法有： miRanda、TargetScan、RNAhybrid、PicTar、miTarget等 生物学实验方法寻找miRNA 靶基因 由于计算机模拟在预测 miRNA 靶基因时存在一定的局限性, 因此很多学者也希望能够利用生物学实验方法直观地寻找 miRNA 靶基因。 一般可以从两个水平去寻找miRNA靶基因 从 mRNA 水平寻找 miRNA 靶基因 从蛋白质水平寻找 miRNA 靶基因 从 mRNA 水平寻找 miRNA 靶基因——基因芯片法 将 miRNA 成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中, 使得 miRNA 在细胞中过表达, 之后利用基因芯片分析 mRNA的变化以找出相应 miRNA 的靶基因。 由于miRNA在体内通过翻译抑制或影响 mRNA的稳定性起作用, 因此这种方法在寻找起翻译抑制作用的miRNA 的靶基因时存在一定困难. 从 mRNA 水平寻找 miRNA 靶基因——免疫共沉淀法 利用 AGO 蛋白家族既能结合 miRNA 又能结合 mRNA 的特性, 分别使用AGO-1 和 AGO-2 蛋白的单克隆抗体在人类细胞中进行免疫共沉淀, 得到与 AGO-1 和 AGO-2 蛋白结合的mRNA 各 600 条, 并通过克隆测序对这些 mRNA 进行鉴定. 同时从与 AGO-1 蛋白结合的 mRNA 中随机挑选 6 条进行荧光素酶报告基因检测, 发现其中有 5条都是 miRNA 的靶基因. 从蛋白质水平寻找 miRNA 靶基因——细胞培养稳定同位素标记技术 分别将成熟 miRNA 双链转染 HeLa细胞, 利用细胞培养稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture), 将转染了成熟 miRNA 双链的细胞和正常细胞分别培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中, 经过若干次细胞倍增后, 稳定同位素按照序列特异的方式完全掺入到新合成的蛋白质中, 通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化实现对蛋白质的精确定量. 在检测了 2000~5000 个蛋白后, 两个研究组分别发现, 转染一条 miRNA 后有几百个蛋白的表达水平发生了改变, 许多改变在 mRNA 水平上不能得到体现. miRNA 靶基因的鉴定 目前最为常用的 miRNA 靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法. 其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体, 将希望鉴定的 miRNA 靶基因的 3′UTR 构建到荧光素酶