gateway重组技术（整理）（一）.pdfVIP

Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由 Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物 学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转 入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体 间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1 和att L2 两个侧端重组序列，来构建 一个类似通道的结构并称之为“入门克隆” （Gateway Entry Clone）。据Invitrogen 宣称 Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限 制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大 大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高 通量基因克隆技术 （Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后， 就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的 基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌 的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的attB 位点可以 发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位 点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和 IHF、Int 的共 同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解 下来 （见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。 1 图1、噬菌体位点专一性重组的机制 在Gateway 系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1 和attL2，大小均为100bp， 中间夹着一个自杀基因——ccdB 基因。由于ccdB 基因的表达产物能抑制普通的 E.coli 生 长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载 体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB 基因两端可以选择的酶切位点有限（2 个）， 同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway 系统提供了5 种不同 的入门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含 F 附加体的，因为它表 达的一种产物能阻断ccdB 基因，影响筛选结果。 同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway 系统配套，即目的载体的表 达调控元件下游有两个重组位点 attR1 和 attR2，大小均为 125bp，同样也夹着一个ccdB 自杀基因。 当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector） 时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis 等重组因 子的LR 重组酶混合物，attR2 序列和attL2 序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1 序列 再和attR1 序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自 杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和 带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点 attP1、P2，见图 2 ）。由于带自杀基因的载体 不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90% 以上。 图2、gateway 机制 由于在这个反应中attL1 序列只和attR1 序列重组，attL2 序列只能与attR2 序列重组， 这个方向的反应称为LR 反应。LR 反应生成新的位点称为attP1/2（200bp ）和attB1/2（25bp ） 序列。 在一定的条件下，attP 和attB 序列也能发生重组，生成attL 和attR 序列，这个反