《实验一 革兰染色法》.pptVIP

实验一 革兰染色法 实验一 革兰染色法 1.掌握油镜的使用 2.熟悉革兰氏染色法原理、 步骤、结果、意义 3.掌握细菌的基本形态和特殊结构 实验目的要求 细菌染色的方法 单染法:采用一种染料染色,只能观察细菌的形态和排列特征，不能观察细菌的染色特性和进行鉴别。 复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。 革兰染色法 该染色法是丹麦细菌学家革兰于1884年创建的,至今仍广泛应用用于细菌分类和鉴别 革兰染色法的原理 ★渗透学说：与肽聚糖的结构有关 革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，酒精不易渗透，反而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗出。 革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精易渗透进入细胞内，将染料脱出。 ★化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关 革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。 ★等电点学说：与细菌所带电荷有关 革兰阳性菌等电点低（pI）为2~3，在中性或碱性环境中所 带负电荷多；革兰阴性菌pI为4~5，所带负电荷少，影响结合染色的多少 实验材料与方法 材料: 菌种：葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（18-24h） 牙垢 试剂：结晶紫染液、碘液 95%酒精、稀释苯酚复红液 其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等 染色标本检查基本程序 涂片 干燥 固定 染色 镜检 初染1min 结晶紫 媒染1min 碘液 脱色15-20s 复染1min 复红/苯酚 95%乙醇 G+ G- 革兰氏染色步骤与现象 注意：每一步染色后水冲，甩干水 (1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。 (2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。 (3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。 涂片观察（P3） P3 注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 ?如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 ?如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 ?脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。 2. 染色过程中勿使染色液稀释。用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3. 选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 实验完毕后的处理： 1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净： a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯（?）将镜头擦2-3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。` 2.镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。 金黄色葡萄球菌(10×100) 大肠杆菌(10×100) 染色结果 染色结果 螺形菌Spiral bacterium 革兰染色意义 ★鉴别细菌 ★选择抗菌药物 ★研究细菌的致病性 选择抗菌药物 常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌 革兰氏阳性菌通常对青霉素类、第一（或第二）代头孢菌素等高度敏感 ，青霉素可为化脓性细菌感染可首选药物 。 选择抗菌药物 常见的革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、霍乱弧菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药 革兰氏阴性菌对第三代头孢、氨基糖苷类、抗假单胞菌属的青霉素类、多粘菌素等高度敏感，对头霉素类和第二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆菌有效，如肠道病、腹泻为常用药 。 研究细菌的致病性 革兰阳性菌可产生外毒素使人致病。 革兰阴性菌主要以内毒素使人致病。（ LPS作为G-菌内毒素致病 ） 实验步骤 观看鞭毛、荚膜、芽孢的示范片 绘图、写实验报告 细菌的特殊结构形态观察 细菌的特殊结构 芽胞(nuclear material ornucleoid) 枯草杆菌芽孢的观察 芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境。 细菌的荚膜的观察 荚膜（capsule) 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 细菌鞭毛的观察 鞭毛：运动，菌落形态。