miR-503通过靶向PI3Kp85调节上皮细胞间质转化抑制矽尘诱导的肺纤维化.docxVIP

miR-503 通过靶向 PI3K p85 调节上皮细胞间质转化抑制矽尘诱 导的肺纤维化 矽肺病 (Silicosis) 是在生产过程中长期过量吸入含有较高浓度的结晶型游 离二氧化硅 (silicondioxide,SiO2) 粉尘引起的以肺组织不可逆性纤维化为主的 全身性疾病 , 是我国最严重的职业病之一。矽肺病患者早期临床症状较轻或不明 显 , 随着病情的发展可出现咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、胸闷等临床表现。 矽肺的基本病理改变是矽结节的形成和肺间质的广泛纤维化。 大量的研究也 表明其病理机制可能有上皮组织化生与凋亡、 纤维母细胞的募集、 成纤维细胞的 增殖并转化为肌成纤维细胞、 细胞外基质 (extracellular matrix,ECM) 的过度沉 积等。 由于矽肺病的发病机制并未完全清楚 , 目前尚无特效治疗方法。但随着科学 的发展和研究的深入 , 越来越多的证据表明 microRNAs(miRNAs,miRs)和上皮间 质转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT) 在纤维化疾病 ( 包括矽肺病 ) 的发病过程中发挥着至关重要的作用。 EMT是具有极性且相连的上皮细胞转化为非极性且缺乏细胞间连接的间充 质细胞的过程 , 这一过程可以增强细胞的运动性或迁移性。在促纤维化细胞因子 的作用下 , 肺泡 II 型上皮细胞 (Alveolar type Ⅱ epithelial cells,AT2) 会通 EMT的过程转化为肺间质细胞 , 如成纤维细胞和肌成纤维细胞等 , 从而促进纤维化的发展。 在发生 EMT过程中 , 上皮细胞也逐渐失去上皮表型 ( 丢失上皮标志物如 E-cadherin 、ZO-1 等的表达 ), 并逐渐获得间充质细胞的表型 ( 表达间充质细胞标 志物如 α -SMA、vimentin 等) 。miRNAs是一系列长度为 18-22 个核苷酸的小的非 编码 RNAs。 其生物学功能主要是通过靶定基因的 3’- 非编码区 (3 ’ -untranslatedregion,3 ’-UTR), 抑制其靶基因信使 RNA(messenger RNA,mRNA) 的翻译或降解 , 从而调节基因的表达。越来越多的研究表明在肺纤维化过程 ,miRNAs可以通过靶定纤维化相关基因或 EMT相关基因 , 发挥促进或抑制纤维化的作用。 长链非编码 RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs) 是一类长度超过 200 个 核苷酸序列的非蛋白编码转录子。 大量的研究证实 lncRNAs 可以调节细胞的增殖分化、转移以及 EMT过程。 近年来研究 lncRNAs 功能最多的是其可作为 miRNAs的分子 海绵 吸附 miRNAs,从而可以调控 miRNAs的活性。具有 海绵 吸附功能的 lncRNAs 也被人命 名为竞争性内源 RNAs(competing endogenous RNAs,ceRNAs)。 已有研究表明 lncRNAs 可以通过调节 miRNAs的表达在小鼠肺纤维化模型中 调控 EMT的过程。我们之前的芯片研究发现 miR-503 在矽尘诱导的肺纤维化组织 中的表达降低 , 并在后续的验证实验中得到了证实 , 在动物水平上调 miR-503 可 明显抑制矽尘诱导的肺纤维化。 为了探讨 miR-503 减轻矽肺纤维化的作用机制 , 我们利用小鼠矽肺体内模型 以及支气管与肺泡上皮细胞 (HBE和 A549)的体外模型 , 研究 miR-503 在矽肺纤维 化中影响上皮间质转化的机制及其调控因素。目的 : 通过建立矽尘诱导的小鼠肺 纤维化体内模型、细胞体外模型 , 以及在体内和体外模型中进行 miR-503 的干涉 , 探讨 miR-503 抑制矽尘诱导的肺纤维化可能的分子机制 , 为 miRNA在矽肺病治疗 中的应用提供理论依据。 方法 :(1) 建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型 : 设立空白对照组、生理盐水组 以及不同时间点 (7 天、 14 天、 28 天 ) 的矽尘组 , 以气管内灌注生理盐水粉尘悬浊 液的方法建立小鼠矽肺模型 , 通过肺组织病理切片 HE染色观察小鼠肺纤维化病 变的变化过程。 (2) 利用 SiO2 粉尘悬浊液处理 HBE和 A549 细胞建立体外模型 , 显微镜观察细胞形态改变。 (3)qRT-PCR法检测体内和体外模型中不同时间和浓度下组织和细胞中 miR-503 表达的改变 ;Western blot 法检测体内和体外模型不同时间和浓度的组 织和细胞中 EMT标志物 ( 上皮标志物 :E-cadherin; 间充质标志物 :vimentin 、 α -SMA)表达的改变 , 使用免疫荧光观察 SiO2