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miR-21 小分子抑制剂的筛选及肿瘤靶向治疗的实验研究 近年来 , 微 RNA(microRNAs, miRNAs)作为进化保守的一类非编码 RNAs在调 控基因表达的功能上引起了人们的极大关注。 MiRNAs勺长度大约为 19-25 个核 苷酸序列 , 它通过与靶点 mRNA结合抑制其翻译或启动降解来发挥作用。 目前在人类基因组织中已发现超过 1000 种 miRNAs,它们的异常表达在包括 恶性肿瘤在内的人类多种疾病发生及进展中发挥重要作用 , 并且 miRNA的测序分 析结果揭示其表达特征可以作为某些恶性肿瘤的分子标签 , 对指导恶性肿瘤的分 , 诊断 , 预后及治疗具有重大意义。 因而探索典型的差异表达的 miRNAs,确定其与恶性肿瘤的相关性 , 寻求抑制其活性的高效靶向药物 , 是极具潜力的肿瘤治疗策略。 MiR-21 是人类基因组中最早发现的与癌症相关的微 RNA,在脑胶质母细胞瘤 , 乳腺癌 , 胃癌 , 结肠癌 , 肺癌等多种肿瘤中存在高表达 , 并通过作用于多个靶点参 与了多条与肿瘤发生 , 进展 , 转移 , 治疗耐受相关的信号通路。目前针对 niRNAs 干扰应用较多的是非小分子的核苷酸类制剂 , 但由于投递效率较低且药效学及药 代学特性的缺陷限制了其临床应用 , 因而研发 miR-21 高效的天然小分子抑制剂 将为肿瘤的靶向治疗指明新的方向。 本课题第一部分我们通过利用 3D 结构模拟计算机辅助药物设计的方法构建 出了 pre-miR-21 茎环部位的 3D 结构 , 并与美国癌症研究所小分子数据库中的化 合物进行分子对接 , 从而获得候选小分子化合物。接着对候选化合物进行体外 miR-21 抑制效果检测 , 确定了具有潜力的 miR-21 小分子抑制剂 AC1MMYR2。 AC1MMYR2对 miR-21 的抑制效果具有浓度依赖性及时间依赖性并可以上调 miR-21 功能性靶点 PTEN,PDCD4及 RECK的表达水平 , 并在作用 6h 时 , 对 miR-21 的抑制具有较好的特异性 , 而在作用 24h 时 ,miR-200a/b, miR-218,miR-1280 等 miRNAs表达出现了不同程度的上调。此外 , 与 miR-21 低表达的肿瘤细胞相 ,AC1MMYR2对 miR-21 高表达状态的肿瘤细胞具有更强的抑制效果。 在本课题第二部分中我们发现 AC1MMYR2在抑制 mature miR-21 表达水平的 同时 , 抑制了 pri-miR-21 的表达水平与 STAT3的转录活性 , 而 pre-miR-21 的表达 水平却被上调。进一步的研究证明 AC1MMYR2在 pre-miR-21 生成 maturemiR-21 的过程中发挥作用 , 它通过与 Dicer 竞争性结合 pre-miR-21 茎环结合位点 , 抑制 pre-miR-21 剪切生成 mature miR-21 。 而 STAT3被报道可以与 miR-21 编码基因的启动子上游结合促进 miR-21 的转 录。因而 , 我们推测存在 AC1MM YR2-STAT3-pri-miR-21的反馈环路 , 这在一定程 度上对 AC1MMYR2下调 pri-miR-21 的机制作出了解释。 同时 ,AC1MMYR2对于 Dicer 结合位点的作用具有特异性 , 将 pre-miR-21 茎环 部位的 Dicer 结合位点进行点突变之后 , 突变体的 3D结构与 AC1MMYR2结合力减 ,AC1MMYR2的活性降低。此外 ,AC1MMYR2发挥 miR-21 抑制作用依赖于 Dicer 的表达水平 , 当 Dicer 表达水平较低时 , 限制了 AC1MMYR2对 miR-21 的抑制作用。 本课题第三部分我们重点探讨了 AC1MMYR2抑制 miR-21 表达水平后 , 对 5 种 上皮性肿瘤细胞恶性生物学行为的影响。 AC1MMYR2可降低肿瘤细胞的克隆形成 率 , 并将细胞周期阻滞在 G0/G1期从而抑制了肿瘤细胞的增殖能力；同时 AC1MMYR2促进了肿瘤细胞的凋亡率及 Caspase3/7 活性并抑制了其侵袭和迁移能 力。 此外 ,AC1MMYR2处理后的细胞上皮性标志物 E-cadherin 表达水平升高 , 而间 质性标志物 N-cadherin, β-catenin, ZEB1, ZEB2, MMP9的表达水平降低 , 这表 明 AC1MMYR2在某种程度上可以逆转肿瘤细胞的上皮间质转化。 在 AC1MMYR2处理 6h 后的 U87细胞测序结果中发现 ,534 个差异表达基因显著富集于癌症相关通路 及 TGF-β通路 ( 在 14 条具有统计学意义的信号通路中