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miRNAs及其靶基因在小桐子对低温响应与适应过程中的作用 小桐子是一种具有巨大开发潜力的能源植物树种 , 低温是影响小桐子存活和 生长的主要限制因子。 我们实验室前期研究表明低温锻炼显著提高小桐子的抗冷 性。 已知 miRNAs在植物对逆境胁迫响应与适应中起重要作用 , 但 miRNAs如何调 控小桐子抗冷性尚未见到报道。弄清小桐子低温锻炼过程中 miRNAs参与抗冷性 提高的分子机制 , 获取与抗冷性密切相关的关键 miRNAs及其靶基因 , 有助于我们 更好理解小桐子抗冷性形成的分子机制。 本研究首先进行了小桐子低温胁迫下 microRNAs实时荧光定量 PCR内参的筛 选与比较 , 而后分析了低温锻炼诱导小桐子抗冷性形成过程中一些重要的 miRNAs基因及其对应的靶基因表达的变化 , 为揭示 miRNAs参与小桐子低温锻炼 下抗冷性形成的分子机制提供了一定的理论和实验基础。研究结果如下 :1. 基于 以前的小 RNA-seq结果 , 以低温处理的小桐子为材料 , 挑选 11 个候选内参基因 , 用实时荧光定量 PCR技术检测它们在不同样本中的表达量 , 采用 GeNorm、 NormFinder 和 BestKeeper 软件进行表达稳定性综合分析。 结果表明 , 表达最稳定的基因是 miR6448和 U6,miR6448 的 Ct 值为 23 左右 , 表达丰度适中 ;U6 的 Ct 值为 10 左右 , 表达丰度高 ; 因此 ,miR6448 可作为小桐子低 温胁迫下表达丰度适中的 miRNAs qRT-PCR的内参基因 ;U6 可作为小桐子低温胁 迫下丰度较高的 miRNAs qRT-PCR的内参基因。 2. 通过荧光定量 PCR检测小桐子 低温胁迫下的 32 个差异表达的候选 miRNAs,发现除 miR5284、miR5494、miR6189 外 , 其它 miRNAs的表达趋势与小 RNA-seq的结果一致 ; 检测结果表明 : 在低温胁迫 处理期间经过锻炼小桐子幼苗中 22 个 miRNAs的表达量高于未经过锻炼的 ; 经过 锻炼的小桐子幼苗中 8 个 miRNAs的表达量低于未经过锻炼的 ;2 个 miRNAs的表 达量在经过锻炼与未经锻炼的小桐子幼苗中无显著性差异。 qRT-PCR的结果为低温锻炼诱导小桐子抗冷性形成过程中一些重要的 miRNA 的进一步研究提供一定的实验基础。 3. 通过对 32 个有差异表达的 miRNAs进行的 生物信息学分析 , 对其靶基因预测进行了 GO富集、 KEGG富集和功能归类。 GO富集分析 , 参与脂质代谢过程的靶基因有 10 个 , 有 84 个基因参与蛋白质 去磷酸化、信号转导和代谢过程等生物学过程 ;KEGG富集共获得 212 条 pathway 通路 , 参与植物激素信号传导的靶基因有 12 个 , 参与 RNA转运的靶基因有 12 个, 参与脂肪酸代谢的靶基因有 9 个, 参与磷脂酶的有 5 个靶基因 ; 对预测到的靶基因 进行功能归类 , 大致分为 : 转录因子、蛋白激酶、磷酸酶、合酶、合成酶、过氧化 物酶、过氧化氢酶、还原酶、水解酶、磷脂酶、脱饱和酶。采用荧光定量 PCR 对小桐子低温胁迫下 6 个候选 miRNA及其响应的与膜脂密切相关的靶基因 , 进行 miRNA-mRNA表达模式分析 , 结果表明 :miR5254 对靶基因 PLC起到负调控作 ;miR5284 对靶基因 FAD6起到负调控作用 ;miR6189 对靶基因 FAR起到正调控作 ;miR165、miR4239对靶基因 PLA起到负调控作用 ;miR5827 对靶基因 FAD3起到负调控作用。 从鉴定到的 6 个与低温胁迫下受 miRNA调控的与膜脂密切相关的靶基因中 , 选取 2 个表达量高且变化倍数显著的基因 (FAD3和 FAD6),进行基因克隆、生物信 息学分析及预测蛋白结构 , 为后续使用基因工程手段改良小桐子抗冷性提供了理 论和实验基础。