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试验室常见技术资料 Lab. experiment technology LQ 细胞冻存 1. 试验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；搜集对数生长久细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少许新培养液。吸管吸收培养液吹打瓶壁上细胞，使其成为均匀分散细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(能够留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养) 5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩下1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。 6. 冷存管置于4℃30min20℃30min80℃16～18小时(或隔夜)液氮槽长久储存。(-20 7．统计每一个冷冻管位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 冷冻细胞之活化标准为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，造成细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特征表现才会恢复正常。 1 材料：37℃ 恒温水浴箱 2 步骤： 1、操作人员应戴防护面罩及手套，预防冷冻管可能爆裂之伤害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检验盖子是否旋紧，因为热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 3、取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。 4、常温离心1000rpm，5min，以70% 酒精擦拭保留管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。 5、取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养瓶，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 G418和筛选 1、筛选之前因为每种细胞对G418敏感性不一样，而且不一样厂家生产相同浓度G418活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418最好筛选浓度。 1.G418配制：取1g G418溶于1ml 1MHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保留。 2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，过夜培养，开始加药。 3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定多个梯度，比如先做个100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml。。。。1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不一样浓度筛选培养基。 5.换液：依据培养基颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最好筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死全部细胞最小G418浓度即为最好筛选浓度。通常400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个等级，维持使用筛选浓度二分之一。 2、确定了最好筛选浓度后做稳定转染 1、转染：选择对数生长久细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养二十四小时或更长，到细胞增加靠近汇合时按1：4密度传代，接入12孔板，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合。 2、加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最好筛选浓度配制好G418筛选培养基。 3、换液：依据培养基颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，能够把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性克隆出现，停药培养，待其逐步增大。 4、挑单克隆：显微镜下观察单克隆，加入胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液继续培养。待其逐步增大后转入到48孔中增殖。（及早冻存） 5、单克隆判定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目标基因是否存在。 Lf20XX转染：质粒DNA转染 转染前应筛选适宜DNA:Lf20XX转染百分比。通常根据1:1，2:1，3:1进行筛选。选择转染比率最高者为适宜百分比。筛选适宜细胞汇合度，看高汇合度还是低汇合度转染效率高。筛选时注意观察最好转染时间。 以下操作以24孔板为例： 贴壁细胞： 转染前一天，去不含抗生素培养液500ul接于培养板(细胞密度0.5-2X105个/ml)，转染时细胞融合可到90-95%。 悬浮细胞：准备转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105 个/ml），培养液不含抗生素。 准备混合物： A：将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。 B：使用前轻柔混匀Lf20XX，取适宜剂量用50ulOpti 稀释， 室温放置20min(注意：到stepC时要在25min内完成)。 C：加入A和B，轻柔混匀，室温放置20min. 每孔中加入100ul混合物，