大豆胞囊线虫4号小种抗性候选基因GmSNAP11的克隆与功能验证.pdfVIP

摘 要 大豆胞囊线虫病（SCN, Heterodera glycines Ichinohe ）是世界性的重要病害，每年可导致几 十亿美元的经济损失。在大豆胞囊线虫病的防控策略中，培育抗性品种是行之最为有效的方 法。鉴于大豆胞囊线虫病的危害严重性，开展大豆 SCN 抗性基因/位点的发掘具有重要意义。目 前，由于混合群体分离法的新一代测序技术（BSA-seq ）可以显著加速豆类作物的抗病基因的鉴 定和发掘效率，因此采用该技术来快速鉴定大豆胞囊线虫病的抗性基因/位点是可行的。本研究 主要针对大豆胞囊线虫病4 号小种（SCN4）采用BSA-seq 方法发现了一个新的抗性基因位点和 相应候选基因，初步验证了基因功能，并开发出了诊断分子标记，可应用于大豆胞囊线虫病抗 性育种中。 本研究首先利用晋豆 23 （敏感品种）×灰皮支黑豆（抗性品种）衍生的重组自交系群体 145 个家系为材料，采用胞囊指数的方法鉴定该群体对 SCN4 号小种的抗病指数，然后依据鉴定 结果构建了各包含 15 个家系的抗病和感病基因池，基于BSA-seq 的方法分别对抗病与感基因池 以及双亲进行重测序，依据欧式距离（ED ）和 SNP 指数（SNP-index ）的方法分析比较抗感池 和双亲之间的基因差异，从中选择非同义突变和终止密码子等位点。最终，采用两种方法在 11 号染色体上均发现了一个5.08 Mb 的区间与胞囊线虫4 号小种抗性相关。 经基因注释发现，该区间存在 15 个非同义 SNP 和开始或终止密码子 SNP 位点，包含于 12 个注释基因中，其中两个基因Glyma.11g234400 和 Glyma.11g234500 与 18 号染色体的rhg1 基因 Glyma.18G022600 和 Glyma.18G022500 同源。这两个基因分别编码 （Z ）--红没药烯合成酶-1 相关的 PLAC8 家族同源蛋白和 α-SNAP 蛋白，而且其基因序列与 SCN 抗性位点 rhg1 高度一 致。因此，该区域定义为 rhg1 的同源基因。针对这两个候选基因采用发状根转化的方法进行过 表达和RNAi 抑制表达分析验证基因功能。结果显示，重组自交系群体对SCN4 号小种的抗性反 应显著不同（p 0.0001 ），在两个预测的候选基因中，只有 GmSNAP11 (Glyma.11g234500) 的功 能与GmSNAP18 类似对SCN4 表现出显著的抗性，而另外一个基因对SCN4 抗性没有差异。 聚类分析显示，GmSNAP18 和 GmSNAP11 两个基因是高度相关的，然而，GmSNAP18 比较 多的与祖先 SNAP 相关。在所有的 GmSNAP 基因中，GmSNAP11 和 GmSNAP18 这两个基因在 SCN 侵染时可以在大部分组织中高度表达，GmSNAP18 的转录本表达量是最高的，其次是 GmSNAP11。而且，在大豆中总的α-SNAP 蛋白的主要由这两个基因所调控的。总之，鉴于这连 个基因对 SCN4 抗性具有相似的功能，我们设想rhg1 的同源基因GmSNAP11 的对SCN4 抗性机 理可能也是相同的。基于此，我们开发了针对 SCN 抗性的三个基因位点的诊断标记应用到 145 个重组自交系群体，结果显示同时存在三个位点的大豆种质的 SCN 抗性明显提高。另外，我们 还利用 KASP 标记检测了 1600 份大豆核心种质的抗性位点分布情况，可为大豆 SCN 抗性育种 提供材料和理论依据。 关键词：大豆，胞囊线虫病，混合群体分离法，候选基因，诊断标记，基因聚合 I Abstract Soybean cyst nematode (SCN, Heterodera glycines Ichinohe) causes an estimated annual loss valued at billions of dollars worldwide. Among management strategies for SCN, host plant resistance is the most feasible option and will be easily accepted by fa