茶树SWEET家族基因鉴定、表达分析及低温响应基因 CsSWEET1α_16_17的功能分析.pdfVIP

摘 要 茶树是多年生常绿木本植物，主要分布在热带和亚热带地区，低温是限制茶树生长最重要的 环境因素之一。糖是植物维持生命活动所需能量的主要来源，在植物正常的生长生殖发育及响应 生物和非生物胁迫中起重要作用。植物根据库器官对糖的需求进行分配，糖从源器官进入库器官 需要与膜上的载体蛋白结合才能完成跨膜转运，这些转运糖的膜蛋白被称为糖转运蛋白。当遭受 低温胁迫时，植物体内可溶性糖含量增加，糖转运蛋白通过平衡、分配糖的分布，维持细胞渗透 势平衡，从而提高植物的抗寒能力。SWEETs （sugars will eventually be exported transporters ）家族 是单糖转运蛋白，包含七个跨膜螺旋和两个MtN3 保守结构域，广泛存在于植物、动物和原核生 物中。已有研究表明，SWEETs 糖转运蛋白在植物的生长生殖发育、生物胁迫和非生物胁迫（如 低温）中发挥重要作用。本研究分析了13 个CsSWEETs 的序列信息，采用荧光定量PCR 方法检 测了CsSWEETs 在不同组织和花发育阶段以及不同胁迫下的表达模式，从中筛选出低温响应基因 CsSWEET1a，CsSWEET16 和CsSWEET17 进行深入研究。通过转化酵母己糖转运体缺失突变体鉴 定它们的糖转运能力，通过转化拟南芥并结合生理和分子生物学方法对低温响应基因 CsSWEET1a，CsSWEET16 和CsSWEET17 进行了功能鉴定。主要研究结果如下： 1. CsSWEETs 基因的克隆和生物信息学分析。应用 RT-PCR 技术从茶树中克隆鉴定 8 个 CsSWEETs 基因，根据与拟南芥AtSWEETs 基因的同源性进行命名。结合前期克隆的5 个基因， 分析发现13 个CsSWEETs 基因都具有SWEET 家族典型的MtN3 结构域和七个跨膜结构。通过与 拟南芥、水稻和葡萄 SWEET 家族成员氨基酸序列构建进化树，将13 个CsSWEETs 蛋白分为4 个亚家族。 2. CsSWEETs 基因的表达和糖转运能力分析。组织特异性表达分析发现， CsSWEET1a/1b/2a/2b/2c/3/9b/16/17 在所有的组织中都表达，而 CsSWEET5/7/9a/15 在某些组织如 成熟叶片中未检测到表达。13 个CsSWEETs 基因在花发育过程中的表达模式可以分为三类。分析 9 个能在成熟叶片中表达的CsSWEETs 基因对非生物胁迫、自然冷驯化和茶树炭疽菌侵染的响应 模式，发现有8 个CsSWEETs 基因能够响应非生物胁迫，而CsSWEET3 响应炭疽菌感侵染。通过 转化酵母己糖转运体缺失突变体，发现CsSWEET1a/1b/7/17 对葡萄糖类似物和一种或多种己糖分 子具有转运能力。 3. CsSWEET16 提高转基因拟南芥的抗寒性。CsSWEET16 属于第IV 亚家族，其表达受低温 抑制。通过对启动子接GUS 株系的GUS 染色分析发现，正常情况下在叶片、根、花和果中都有 活性，而低温条件下这些组织中的GUS 活性减弱。亚细胞定位显示 CsSWEET16 蛋白定位在液 泡膜。低温条件下，与野生型植物相比，过表达 CsSWEET16 的转基因株系的相对电导率降低， F /F 值增大，可溶性糖和葡萄糖含量增加，而果糖含量降低。此外，CsSWEET16 可以回复 v m atsweet16-1 突变体果糖积累的表型。这些结果表明CsSWEET16 通过调节液泡内外的可溶性糖分 配，增强拟南芥的抗寒能力。 4. CsSWEET17 的C 端影响糖转运能力。CsSWEET17 属于第IV 亚家族，其拟南芥同源基因 以及同属于第IV 亚家族的 CsSWEET16 都定位于液泡膜，而亚细胞定位结果显示 CsSWEET17 定位于细胞膜。通过氨基酸序列比对，发现CsSWEET17 跨膜结构域外的C 端比AtSWEET17 多 I 67 个氨基酸，去除该C 端后，CsSWEET17 的细胞膜定位特性未受影响，但对果糖、葡萄糖和甘 露糖的转运能力减弱。 5. 超表达 CsSWEET1a 和 CsSWEET17 能够提高糖转运能力。不同糖浓度处理发现， CsSWEET1a-OE 株系在高糖浓度下无法正常生长，在低糖浓度下叶片颜色变黄。CsSWEET17-OE 株系在高糖浓