低温脂肪酶基因的克隆、表达及脂肪酶基因高通量筛选方法的初步建立.pdfVIP

摘 要 脂肪酶是一种特殊的甘油三酯水解酶，其作用条件温和、副产物少、可作用于油-水界面催化 甘油酯水解成脂肪酸和甘油，还能催化水解、酯交换、酯化、醇解、酸解和氨解多种反应。低温 脂肪酶是指在0ºC 仍具有一定催化活性、最适温度不超过30ºC 的脂肪酶，大多数在高温条件下 酶活力较差。低温脂肪酶还具有一定有机溶剂耐受性、偏好C3~C10 长链的脂肪酸酯以及具有更 宽泛的pH 适用范围，因此低温脂肪酶在水产饲料、食品、生物医药、皮革、环境治理、生物柴 油、洗涤等行业有较大的应用前景。 据报道，假单胞菌属 （Pseudomonas ）和气单胞菌属 （Aeromonas ）是低温脂肪酶的主要来源。 为了拓宽低温脂肪酶的基因资源，本论文从微生物中克隆、表达三个脂肪酶基因，获得的重组蛋 白分别命名为PgLip 、PfLip 和BcLip ，分别来源于谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis ）、台 湾假单胞菌（Pseudomonas formosensis ）和枯草芽孢杆菌 （Bacillus clausii ）。酶学性质测定表明， PgLip 、PfLip 和BcLip 最适温度均在20ºC 以下，在0ºC 仍具有较高的酶活力，因此它们都属于 低温脂肪酶。脂肪酶对金属离子普遍具有一定的抗性。此外，虽然在去垢剂SDS 中酶活力丧失较 多，但在其它类型的表面活性剂如Tween-20 、Tween-80 和Triton X-100 中酶活力却大幅度提高； 另外，对于乙醇、异戊醇和异丙醇有机溶剂，相对于低浓度条件，在高浓度有机溶剂中脂肪酶甚 至被激活，表现出独特的特征。因此，三个低温脂肪酶的克隆、表达和生化表征丰富了我们对脂 肪酶生物多样性的科学认识。 我们尝试结合生物传感器的灵敏和流式分选的快速来建立脂肪酶的高通量筛选方法。在对上 述3 个脂肪酶进行详细生化表征的基础上，我们以动态传感器-调节系统为模型、结合生物传感器 和流式分选的方法初步建立了一个用于脂肪酶筛选的高通量筛选体系。首先构建一个对细胞内脂 酰CoA 响应的基因表达盒，该表达盒使用AR 启动子使得其控制下游红色荧光蛋白基因的表达， 并反映胞内脂酰CoA 。脂酰CoA 在胞内会被脂肪酸β-氧化酶系降解进入代谢途径，因此生物传 感器的灵敏度下降；为了增加该传感器的灵敏度，需要将参与β-氧化的相关基因敲除或抑制其表 达。因此我们使用CRISPR/Cas9 技术敲除BL21(DE3)大肠杆菌中的fadE 基因。大肠杆菌的fadE 编码脂酰CoA 脱氢酶，敲除fadE 基因可以阻断脂肪酸的分解代谢，同时又不影响菌株的生长。 因此该基因的敲除使得细胞内的脂肪酸能维持稳定的浓度。以敲除fadE 的大肠杆菌为基础、以 BcLip 脂肪酶为模型构建针对脂肪酸（脂酰CoA 的前体）响应的细胞系统。优化水、油、水乳化 体系，使细菌能较好地形成乳化体系，最终通过流式细胞仪高通量筛选表达脂肪酶BcLip 的大肠 杆菌。在此基础上，构建了一个土壤宏基因组质粒文库，利用上述方法结合生物传感器和流式分 选的高通量筛选方法，初步从土壤样品中筛选出含脂肪酶活性的菌株。 本研究取得了如下结果：通过同源比对，克隆获得三个低温脂肪酶基因；将基因成功在大肠 杆菌中进行表达并对其酶学性质进行生化表征，丰富脂肪酶基因资源、对脂肪酶生物多样性的科 学认识。同时，结合生物传感器和流式分选，我们以所获得的脂肪酶BcLip 为模型初步建立了一 个用于脂肪酶基因的高通量流式筛选方法。应用该方法，成功地从土壤宏基因组质粒文库中筛选 到表达脂肪酶的重组菌株。该方法经优化后可望用于脂肪酶的筛选，因此为脂肪酶筛选提供了新 I 的思路；该方法基于功能进行筛选，因此对方法中的生物传感器元件进行改造后还可能用于其它 饲料酶如木聚糖酶、甘露聚糖酶等的筛选，并有可能获得全新的酶基因资源。 关键词：脂肪酶，基因克隆，高通量筛选，生物传感器，宏基因组 II Abstract Lipase is a special triglyceride hydrolase. Its acting conditio