疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化活性的分子改造.pdfVIP

摘要 摘要 Thermomyces lanuginosus lipase TLL 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶 （ ， ）由于具 有热稳定性好、催化活性高、耐碱性等特点，在生物柴油、洗涤剂、食品、化 妆品、皮革、医药和环境等领域作为工业催化剂应用广泛。然而，工业生产对 脂肪酶的活性和耐受性有着极其严苛的要求，对TLL 进行性质的优化能够克服 其应用瓶颈，降低其生产成本。为了提高TLL 的催化活性等性质，本研究利用 计算机辅助设计和点饱和突变技术以及定点突变技术对TLL 的催化活性及稳定 性进行分子改造，产生的TLL 突变体被证明具有良好的催化活性并且能够很好 的应用到生物柴油工艺中。 1. 我们利用半理性设计，通过点饱和突变技术对TLL 进行分子改造。选取 TLL G23 D62 D96 5760 上的三个氨基酸位点 （ ， ， ）进行三点饱和突变，完成了 个突变体的筛选，得到12 个酶活提高的的突变体。 （1）通过分析突变体的性质，我们发现TLL 的第96位氨基酸与其催化活 G23 D62 D96 性和酶学性质关系紧密，且 ， ， 这三个位点的复合突变可以获得酶 学性质更加丰富的突变体。 （2）且突变体G23A/D62K/D96H、D62R/D96E、D96Q、D96M、D96K、 D62T/D96R pH 10.0 D62T/D96R G23V/D96R G23L/D62V 的最适 变为 ； 、 、 的最 适温度升高为60℃；G23T/D96R 在80℃下处理45min，相对剩余酶活为47.3%， 热稳定性较TLL 有所提高；D96M、D96K 的pH 稳定区间较TLL 变宽；D96M、 D96K G23L/D62V G23V/D96R TLL 、 、 对底物的亲和力和催化效率均高于 。 2. 我们利用Rosetta 软件的ddg_monomer 模块进行单位点饱和突变计算， 预测稳定性能够得到提高的TLL 突变体。对预测结果进行总结、分析后我们发 现TLL 表面带电氨基酸极具影响TLL 稳定性的潜力，因此我们对TLL 带电氨 基酸D111、D158、D165、R205、R209、R232、E239、D254 位点进行定点突变。 （1）结果发现4 个带负电氨基酸D111、D158、D165 和E239 位点的突变 能产生催化活性提高的突变体，并且相对应的生物柴油的转酯率有显著提高。 结构学分析发现这4 个带负电的氨基酸D111、D158、D165和E239远离活性中 心，将其突变为其它氨基酸时TLL 的表面静电势会受到影响，致使TLL 产生性 I 摘要 质丰富的脂肪酶突变体。其中，TLL 突变体D165E 的催化活性和热稳定性较野 生型TLL 均有提高，且对生物柴油的转酯率高达93.56%。 （2）突变体D111E、D158F、D158H、D165E 最适温度提高为60℃；D165A R209D 80 45min 50% TLL 和 在 ℃下处理 ，相对剩余酶活降为 左右，其热稳定性较 有一定提高；D158H、D164E、R232E、E239R、D254R 的pH 稳定性提高；R232F、 D165A、E239R 对底物的亲