口蹄疫病毒前导蛋白抑制NF-κB介导的Ⅲ型干扰素表达的研究.pdfVIP

摘 要 口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV ）是家畜口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD ） 的病原，主要侵染牛、羊、猪等偶蹄动物，引起传染性极强的群发疫病。该病的特征症状是口、 鼻、蹄和乳房等部位出现水疱，可见FMDV 主要侵染宿主的上皮组织。近几年发现的IFN-λ3 是 III 型干扰素（interferon, IFN ）的成员之一，主要产生靶向上皮组织的专一抗病毒效果。目前，对 FMDV 与猪源IFN-λ3 的关系了解甚少，因此，猪源IFN-λ3 的研究将为更加有效防控FMD 提供 新的思路。 FMDV 前导（leader ）蛋白（Lpro ）是拮抗宿主细胞天然免疫应答的重要蛋白。Lpro 能通过多 种途径调控IFN 的表达，推测也能调控IFN-λ3 的产生。为了获得抗Lpro 抗体，本研究采用原核 表达获得了重组Lpro ，利用其制备了高效价的兔抗血清，该血清能够特异性识别FMDV 感染过程 中产生的Lpro 。为了获得猪源IFN-λ3 蛋白，将猪源IFN-λ3 基因定向克隆至原核表达质粒pET-28a （+ ）中，利用大肠杆菌BL21 表达了目的蛋白，最终获得了重组猪源IFN-λ3 蛋白。 用纯化的猪源IFN-λ3 蛋白研究其对FMDV 复制的影响，发现IFN-λ3 以剂量依赖性方式抑 制FMDV 增殖，用siRNA 技术将细胞内IFN-λ3 进行基因沉默后，发现FMDV 的复制水平升高， 这些结果说明猪源IFN-λ3 具有抗FMDV 复制的作用。本研究也检测了FMDV 感染对IFN-λ3 表 达的影响，结果显示病毒感染减少了poly(I:C)诱导的IFN-λ3 生成，表明FMDV 能够利用某种机 制拮抗IFN-λ3 的抗病毒效应。本研究发现FMDV 编码的Lpro 发挥抑制IFN-λ3 表达的作用，且该 抑制作用与Lpro 的切割功能相关。 Jaspar 软件预测结果显示猪源IFN-λ3 启动子序列上有NF-κB （nuclear factor kappa-B ）结合 位点。p65/RelA 是NF-κB 的活性亚基，有调控IFN 转录的作用，据此推测p65/RelA 很可能参与 IFN-λ3 的激活。实验结果发现，过表达p65/RelA 显著升高IFN-λ3 的mRNA 的水平，还能抑制 FMDV 的复制，说明p65/RelA 确实参与调控IFN-λ3 表达。接下来探究Lpro 能否通过作用p65/RelA 而调控IFN-λ3 的产生，Western blotting 试验证明Lpro 不仅能降解内源p65/RelA ，还能切割外源 p65/RelA ，而且切割位点突变后不能检测到 p65/RelA 切割条带。间接免疫荧光试验 （indirect immunofluorescent assay, IFA ）结果显示Lpro 与p65/RelA 在细胞核共定位。以上这些发现表明Lpro 能够直接切割p65/RelA ，Lpro 与p65/RelA 的相互作用导致Lpro 下调p65/RelA 介导的 IFN-λ3 表 达，该下调能力也与Lpro 的切割功能有关。 综上所述，本研究制备了Lpro 兔抗血清和猪源IFN-λ3 蛋白，发现FMDV 利用自身编码的Lpro 切割p65/RelA 从而拮抗IFN-λ3 抗病毒反应，深化了对FMDV 致病机制的认识，为发展新型FMD 防控技术提供了理论支持。 关键词：口蹄疫病毒，前导蛋白，猪源IFN-λ3 ，NF-κB I Abstract Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is the pathogen of foot-and-mouth disease (FMD) in livestock, which mainly infects cloven-hoofed animals, such as cattle, sheep, and pigs, and causes highly contagious epidemics. The chara