实验3PEG介导的动物细胞融合技术.docxVIP

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名：常天易 系年级：海洋生命学院 2012 级 专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验 学号：12050011006 PEG 介导的动物细胞融合技术 一、实验目的 （１）、通过实验，对体细胞融合有一个清醒的认识 （２）、通过ＰＥＧ介导鸡血细胞融合，初步掌握利用ＰＥＧ介 导动物细胞融合的实验技术。 二、实验原理 真核细胞通过介导和培养， 两个或多个细胞合并成一个双核或多 核的细胞的过程称为细胞融合， 通过此技术可以实现不同种类的细胞 的融合。基因型相同的细胞融合称为同核体（ｈｏｍｏｋａｒｙｏ ｎ），基因型不同的细胞融合称为异核体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏ ｎ） 目前，诱导细胞融合的技术主要有三种：病毒，聚乙二醇（ＰＥ Ｇ），电激。第一种方法是通过生物病毒的方式，诱导细胞与细胞之 间的融合。后两种方法通过化学物理的手段使得细胞膜的膜脂类分子 的排列发生变化， 去掉作用因素后， 质膜分子的排列恢复原有的形态， 在恢复的过程中，可以诱导相接触的细胞发生融合。 ＰＥＧ介导的细胞融合，其融合效果受到以下几个因素的影响 ①、ＰＥＧ的分子量与浓度 ＰＥＧ的分子量及其浓度越大， 细胞融合效果越明显， 但对细胞 的毒性也越大。 本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ， 浓度为５ ０％ ②、ＰＥＧ的ｐｈ值 经验证，ＰＥＧ的浓度在８ .０～８.２时，融合效果最好 ③、ＰＥＧ处理时间 处理实验越长， 融合效果越好，但对细胞的毒性也越大。故一般 将处理时间限制在１分钟以内。 本实验不涉及后续的细胞培养， 所以 处理时间可适当放宽至数分钟 ④、融合时的温度 温度越高， 细胞膜脂质的流动性越好， 故在细胞可以承受的范围 内，适当的提高温度有利于细胞的融合 三、实验材料 新鲜鸡血 ０.８５％生理盐水 ＧＫＮ液 ５０％ＰＥＧ液 四、实验步骤 取出鸡血悬液 1ml，加入 0.85%生理盐水， 4ml，混匀。 1200r/min 离心 5 分钟，移除上清液 加入 4ml 0.85%生理盐水，重悬细胞， 1200r/min，离心 5min， 移除上清 加入 4ml 0.85%生理盐水，重悬细胞， 1200r/min，离心 10min， 移除上清 向离心沉淀中加入 2mlGKN ，使之成为 10%的细胞悬液 取血球悬液 1ml，加入 0.5ml 50%的 PEG 液，混匀，开始计时 从计时开始，到盖上盖玻片在显微镜下观察为止。将处 理 1、2、3、4 分钟的细胞样品，显微镜下观察计数视野内融 合细胞的核数和视野内细胞的总核数，从而计算融合率 计数视野内融合细胞的核数和视野内细胞的总核数，从而计算融 合率 融合率 视野内融合细胞的核数 视野内细胞核的总数 100% 五、实验结果 本实验分为四个实验组， 经 PEG 处理的时间分别为： 1,2,3,4 分 钟，各个实验组中视野内融合的细胞的核数，视野内细胞核的总数， 融合率如下： 视野内融合的细胞的 视野内细胞核的总 融合率 处理时间 （%） 核数 数 项目 1min 93 137 67.9 2min 134 186 72.0 3min 198 256 77.3 4min 258 320 80.6 处理 2min 效果 六、思考题： １、细胞融合方法主要有哪几种，各有何优缺点？ 答： 目前主要由三种方法，ＰＥＧ、病毒法、电激法。 ①、ＰＥＧ介导的细胞融合 优点：细胞融合率较高，廉价，操作简便 缺点：ＰＥＧ对细胞有一定的毒性， 不适用于对卵细胞的细 胞融合，可重复性差。 ②、病毒法 ,使用副念病毒科的病毒诱导细胞融合 优点：病毒体外易于培养 缺点：使用病毒诱导的细胞融合效果不稳定 ③、电激法： 优点：可重复性强，对细胞无毒害 缺点：成本高 ２、ＰＥＧ法诱导细胞融合的因素有哪些？ 答： ①、ＰＥＧ的分子量与浓度 ＰＥＧ的分子量及其浓度越大， 细胞融合效果越明显， 但对细胞 的毒性也越大。 本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ， 浓度为５ ０％ ②、ＰＥＧ处理时间 处理实验越长， 融合效果越好，但对细胞的毒性也越大。故一般 将处理时间限制在１分钟以内。 本实验不涉及后续的细胞培养， 所以 处理时间可适当放宽至数分钟 ③、ＰＥＧ的ｐｈ值 经验证，ＰＥＧ的浓度在８ .０～８.２时，融合效果最好 ④、融合时的温度 温度越高， 细胞膜脂质的流动性越好， 故在细胞可以承受的范围 内，适当的提高温度有利于细胞的融合 3、本实验中所用的 PEG融合方法是否适用于植物细胞，为什 么？ 答： 不适用。 因为植物细胞存在细胞壁， 使用ＰＥＧ融合方法使得细胞的细胞 膜的脂类分子层结构发生暂时的改变， 从而介导细胞的融合。 由于细 胞壁的存在， 组织了植物细胞的融合， ＰＥＧ融合方法所以不适用于 植物细胞的融合。