生物化学实验：第六次试验.docVIP

实验七 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白 实验目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 实验原理： 蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。 本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。 血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。 用醋酸纤维薄膜作蛋白电泳有简便，快速，分离清晰，容易定量等优点。 实验仪器 1、? 牛血清 2、? 醋酸纤维薄膜 3、? 镊子 4、? 电泳仪 5、? 电泳槽 6、? 盖玻片 四．实验试剂 1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。 2、?染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。 3、?漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。 五．实验步骤 1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。 2、点样：取盖玻片一块，用玻璃棒将血清均匀的涂在盖玻片的一端面上，直直的在薄膜一端1/3处点样。 3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。 4、?染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。 5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。 6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。 六．实验结果 实验结果：可以看到三条带，最靠近起点的是γ-球蛋白，离原点最远的是清蛋白。 七．实验分析 1．注意事项： （1）请带试验的老师试验结束后，将镊子回收。 （2）醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面。 （3）电泳槽中间为正极，两端为负极。 （4）染色液请用完后回收到原来的试剂瓶中。 （5）漂洗薄膜时，请做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，这样既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。 2．思考题： 1．电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 答：点样端放在负极，因为在血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。所以要将点样端放在负极。 2. 醋酸纤维素膜作为电泳支持物优点？ 用醋酸纤维薄膜作蛋白电泳有简便，快速，分离清晰，容易定量等优点