生物化学实验：第三次实验.docVIP

实验三 福林（Folin）—酚试剂发测定蛋白质浓度 一．实验目的 熟悉并掌握Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法 二．实验原理 蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。 此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定。 三．实验仪器 蛋白质及其水解产物 722型（或7220型）分光光度计 试管1.5cm×15cm(×8) 吸管0.50ml(×4)、0.10ml(×2)、0.20ml(×2)、5.0ml(×1)。 四．实验试剂 1、Folin-酚试剂A：1g Na2CO3溶于50ml 0.1mol/L NaOH溶液。另将0.5g CuSO4·5H2O溶于100ml 1%酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液。将前者50ml于硫酸铜-酒石酸钾溶液1ml 混合。混合后的溶液一日内有效。 2、Folin-酚试剂B：将100g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g 钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、700ml蒸馏水、50ml 85%磷酸及100ml 浓盐酸置于1500ml 磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10h。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml 及液溴数滴，开口煮沸15min，驱除过量的溴（在通风橱内进行）。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液呈微绿色，贮于棕色瓶中。临用钱，用标准氢氧化钾溶液滴定，用酚酞做指示剂（由于试剂微绿，影响滴定终点的观察，可将试剂稀释1000倍再滴定）。根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸（稀释1倍左右），贮于冰箱中可长期使用。 3、卵清蛋白溶液：将含1mol/L的卵清蛋白溶液准确稀释至500μg/ml。 五．实验步骤 1、标准曲线的绘制 将7支干净试管编号，按表13顺序加入试剂 混匀，室温放置10min，各管再加Folin-酚试剂B 0.5ml，30min后比色（500nm），做吸光度-蛋白质浓度曲线。 Folin-酚法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号试剂 0 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白/ml 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水/ml 0.5 0.45 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Folin-酚试剂/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 浓度μg/ml 0 5.56 11.11 22.22 33.33 44.44 55.55 2、样液测定 准确吸取样液0.5ml 置干净试管内，加入4ml Folin-酚试剂A，10min后，再加试剂B 0.5ml，30min后比色（500nm），对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。 六．实验结果的计算 Folin-酚试剂测牛血清蛋白质的吸光度 管号测量次数 0 1 2 3 4 5 6 样液 1 0.000 0.123 0.355 0.389 0.614 0.766 0.810 0.474 2 0.000 0.125 0.355 0.390 0.614 0.766 0.813 0.473 3 0.000 0.125 0.355 0.391 0.614 0.766 0.814 0.474 平均值 0.000 0.124 0.355 0.390 0.614 0.766 0.812 0.474 吸光度-蛋白质浓度曲线 样液的蛋白质浓度= [﹙0.474﹣0.0226﹚÷0.1544﹣1 ] ×11.11=21.371μg/ml 七．实验注意事项及思考题 注意事项： 在实验时，不要将牛血清蛋白和样液加反了； 一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如果时间超过了30分钟，则测得的光密度值就不准确了； 由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的时候要尽量做到准确； 在使用分光光度计时，那比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污是测量值不准确； 在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦； 在比色皿中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二 比较蛋白质测定的几种方法 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％ 费时8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法 灵敏度低1～20mg 中速20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液