医学遗传学综合实验.docxVIP

第五章 医学遗传学综合实验 一、实验目的 掌握利用系谱与 DNA检测所得到的信息相结合用于产前基因 诊断的方法； 了解DNA分析技术在遗传病产前基因诊断中的应。 二、实验原理 （一）PCR-RFLP分析技术 PCR-RFLP分析技术是在 PCR技术基础上，根据限制性内切酶识 别位点改变而导致的酶切位点增加或消失的特点，对 DNA进行鉴定； 利用PCR特异扩增的 DNA片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶 切割后，通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异 同，判断该 DNA是否存在突变。应用 PCR-RFLP分析技术可以检测 已知的点突变，也可以在家系中连锁分析进行基因诊断。 （二）F皿基因 F皿基因位于人类染色体 Xq28，长186kb，由26个外显子及 25 个内含子组成。根据 F皿基因序列，本实验利用 PCR结合RFLP设计 了一对特异性引物， 首先扩增出F皿基因长度为142bp的特异性片段， 然后选择Bcl I限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化， 野生型基因拥 有限制性核酸内切酶 Bcl I的酶切位点，可被切为99bp和43bp两个片 段；而突变型基因没有限制性核酸内切酶 Bcl I的酶切位点，不会被 Bcl I切断，酶解后仍为142bp的片段；如果酶解后142bp、99bp和43bp 片段均出现，说明是野生型基因与突变型基因的杂合子（图 5-1,图 5-2 ）。 图5-1 PCR-RFLP分析F皿基因原理图 图5-2 PCR-RFLP分析F皿基因结果示意 （三）血友病A病例 姓名：李XX 性别：男 出生日期：1979年5月 民族：汉 现住址：XXXXXX 就诊日期：2000年7月（XX医科大学XX临床学院血液室） 主诉：反复出血不止、关节肿痛 15年，加重1年 现病史：15年前，于轻微外伤后出血不止，外用凝血药止血后未 予治疗。此后齿龈、舌、口腔、鼻经常出血，而膝、踝、肘等部位常于 轻微外伤后出现淤斑、关节肿痛，症状逐年加重。 查体：神志清楚，语言流利，贫血貌，膝、踝、肘关节僵硬变形， 肌肉萎缩。 实验室检查：①凝血时间延长；②凝血活酶时间显著延长；③血浆 中抗血友病球蛋白减少； ④出血时间、凝血酶源时间、纤维蛋白原含量、 毛细血管脆性及血小板数均正常。 【注：血浆因子皿活性的正常均值定为 100% （范围50%?200%）。 甲型血友病血浆因子皿活性水平低于 5%,重型V 2%。】 家族史：家系中两个舅舅曾患类似病死亡， 现有一同胞弟弟患有同 病，同胞现年 7岁，已出现出血时间延长，出血不止症状。 三、实验准备（材料、试剂、仪器） （一）试剂 模板 DNA （50ng/ 1）、引物 I 和 H （ 20 ^M）、TaqDNA 聚合 酶（5u/ v 1）、10XPCR反应缓冲液、dNTP （2.5mM ）、灭菌蒸馆水、矿 物油、限制性内切酶 Bcl I （20U/ v l）、10X酶切缓冲液。 30%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29： 1）、5XTBE、2%过硫酸铉、 TEMED、6X上样缓冲液、 DNA分子量标记、5mg/ml漠化乙锭（EB） 染液、无水乙醇 （三）仪器和设备 PCR白动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器、枪头及离心管、 容器盒、恒温水浴箱、制胶玻璃板、制胶架、聚丙烯酰胺凝胶电泳装 置、5ml注射器、12号针头、25 v l玻璃注射器、烧杯、脱脂棉、保鲜 膜、染色盒、微波炉、 250ml三角烧瓶、透明胶带、称药盘、天平。 四、实验方法与步骤 （一） PCR反应 PCR反应体系20 k l,其成分如下： TOC \o 1-5 \h \z 模板DNA 2 v l 10 x PCR缓冲液 2^ l TaqDNA 聚合酶 0.2 l 2.5mM dNTP 1 l 20M Primer I 0.5 l 20M Primer II 0.5 l ddH2。 13.8 v l 总体积 20 v l PCR 反应循环温度：95 C 变性 2min , 94 C 40s; 55 C 30; 72 C 50 C , 共30个循环，最后经 72 C延伸5min ,反应结束后置 4 C冰箱保存 （二） PCR产物的Bcl I酶切 反应体系30 v l其成分如下： TOC \o 1-5 \h \z PCR扩增产物 12^ l 10X酶解缓冲液 3 v l Bcl I限制酶 1 v l ddH2O 14v 总体积 30 v l 置50C水浴消化 2小时，4C保存。 （三） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 .制备12%聚丙烯酰胺凝胶 5 ml。力口 TEMED 5 l和0.4ml过 硫酸铉，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全凝聚后，拔出加样梳子， 安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1XTBE ）,缓冲液应高于加样孔上缘， 用注射器吸取缓冲