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医学遗传学实验讲义 浙江大学医学院 医学遗传学课程组 2012年9月3日 实验一人类外周血染色体标本制备 一、 实验目的 通过实验了解和掌握人类外周血染色体标本培养和制备的基本方法。 二、 实验原理 正常情况下，外周血中的小淋巴细胞， 几乎都处在Gi期或Go期，外周血细胞中是没有 分裂相的。1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素 （phytohemagglutinin, PHA ）或其它有丝分裂刺激剂的影响下， 在形态上转变为淋巴母细胞， 在培养中进行有丝分裂。这样经过短期培养（ colchicine ）,秋水仙素的处理，低渗和固定， 就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。 本方法已为临床医学、病毒 学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 三、 实验准备 实验材料 人外周血（淋巴细胞） 实验器具 离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头（ 6 1/2号）、 吸管、量筒、火柴、酒精灯、 pH计、研钵、饭盒、超净工作台、镶子、载玻片、玻片盒、 烧杯、染缸、试管架、玻璃铅笔或记号笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。 药品和试剂 培养液的配制 RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠） 80% 小牛血清（56 C水浴灭活30分钟，灭活可破坏补体及一些污染的病毒 ） 20% 植物血凝素PHA （主要成分是粘多糖和蛋白质，可用培养基溶解） 4% 青霉素终浓度 100U/ml 链霉素终浓度 100U/ml 用3.5%NaHCO3调pH7.0?7.2,用玻璃滤器，抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养 瓶中（每瓶含培养基5 ml）。培养液置于-20C冰箱保存。使用前从冰箱中取出， 温育至37 Co 2 .肝素 浓度为0.2%，作为抗凝剂使用。200 mg肝素粉末溶于100 ml生理盐水中。高压灭菌， -4C冰箱保存备用。 KCl 浓度为0.075 M , 0.559 g氯化钾溶于100 ml双蒸水中。氯化钾作为低渗液的优点是染 色体轮廓清楚，可染性增强，时间缩短。 秋水仙素 10 Pg/ml,作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中 期。称取10 mg秋水仙素溶于100 ml生理盐水中，配成 100 Pg/ml的原液，分装小瓶，高 压灭菌，-20C冰箱保存备用。临用时取上述原液用生理盐水稀释成 10 Mg/ml。 甲醇 冰醋酸 吉姆沙（Giemsa）染液 吉姆沙原液：先将 0.5g吉姆沙粉末干研磨，时间越长越好；加 33 ml 60C预热的纯甘 油，在研钵中研磨，放在 60C恒温水浴中保温 90分钟。冷却后，再加入 33 ml甲醇，充分 搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存，作为原液。原液要提前半年配制。原液中按比例 加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。 1份Giemsa原液+ 9份磷酸缓冲液 磷酸缓冲液（pH 6.8） 溶液A :磷酸二氢钾（KH 2PO4.2H2O） 9.078 g溶于1000ml蒸储水中。 溶液B:磷酸氢二钠 （Na2HPO4.2H 2O） 11.876 g溶于1000ml蒸储水中。 100ml缓冲液：需溶液 A50.8 ml ,溶液 B 49.2 ml。 四、实验步骤 米血 先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取 2 ml干燥灭菌注射器，配上针头（6 1/2号）并吸 取肝素液0.2 ml湿润针筒，采静脉血 2 ml,转动针筒使血与肝素混匀。 培养 采血完毕立即将针头插入含 RPMI 1640培养瓶内（瓶盖预先用酒精棉球消毒） ，每瓶滴 入30滴血，摇匀。2 ml血可分装三至四瓶。置 37C 土 0.5C恒温中培养72小时，其间可摇 动2~3次。 秋水仙素（colchicine）处理 在终止培养前2~3小时，加入秋水仙素，6 1/2号针头3滴（每ml约60滴），使细胞分 裂终止在中期。秋水仙素的浓度不宜过高和作用时间过长， 虽然这样做可以得到较多的分裂 相，但导致染色体过分缩短，不宜用于显带分析。 离心 将培养物倒入刻度离心管内，以 1000rpm离心10分钟，弃去上清液，留底层沉淀物并 用吸管打匀。 低渗处理 加8 ml预温（37C）的0.075 M KCl低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中， 37C水 浴箱静止25~30分钟，使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。低渗处理的效果与低渗的 成分、处理的时间和温度有关。 这是比较关键的一步， 对任一组织和低渗液都要事先进行预 实验，以确定最合适的处理时间。 预固定 在低渗25~30分钟后，加新配置的固定剂（甲醇 ：冰醋酸，3:1 ） 1ml,打匀。这样有助 于细胞的均匀悬浮而不团聚凝块和防止细胞丢失。 甲醇和冰醋酸要现配现用，如放置时间较 长，即不宜再用，以免影响固定效