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单克隆抗体制备操 作方法及注意事项 JEN 无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必 须戴上，最好戴上帽子、手套； 2、 进去后用酒精棉球擦洗手； 3、 生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当 日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀 菌； 4、 无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可； 5、 有关试剂使用后及时用封口膜封住； 6、 细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均 需注意瓶口，避免污染瓶盖； 7、 出门后需要用钥匙锁上； 8、 整个无菌间两周清洁一次； 免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常 见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射 2-3只小 鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好； 首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧 皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡； 间隔两周左右时间 （14天） 二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部 皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在； 间隔两周左右时间 （14天） 三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部 皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在； 间隔7-10天左右时间 尾部采血测定抗体效价： 方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝 下，小鼠保定后将其尾巴置于 50热水中浸泡数分钟，使尾部血管 充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖 1?2mm,用试管接 流出的血液，同时白尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球压迫止血 并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量 0.1ml。 方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢 协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦 洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性 1ml注射器穿刺 血管，用10微升移液枪及时吸取全血 2.5微升，加在盛有97.5微 升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测 定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于 12.8万 倍。 实际操作显示，采血使用剪尾方法较好，一人固定小鼠，另一人 直接在尾端剪掉 1-2mm,从尾根部向尾尖部按摩，在尾端可见一 滴血，吸取2.0微升加在2ml的PBS溶液中，直接稀释1000倍， 混匀，再倍比稀释测定效价； 当日或次日，对全血用生理盐水进行倍比稀释，测定抗体效价， 效价未达到标准，则继续进行常规免疫，效价达到标准，则选择 效价最高的一只小鼠作为脾细胞源鼠，并在细胞融合三天前尾静 脉注射加强免疫。 随后，取冻存好的瘤细胞进行复苏、培养、扩瓶，直到单只小鼠 细胞融合需要稳定良好生长瘤细胞培养液约为 120ml （大约一周 能够完成），之后可进行细胞融合实验； 在细胞融合三天前（72-96小时），直接尾部静脉注射 50微 克抗原加强免疫；先用烧杯固定小鼠露出尾巴，用温水（水温约 50度左右）泡大约2分钟，这样能使血管充分舒张。用干棉球擦 干；用1毫升注射器选择两侧较浅的静脉穿刺注射抗原，位置选 择尾部中下213-1/2处比较好，从下向上扎，万 次扎不进，还能 够继续使用此血管。具体操作是左手食指和中指上下夹注你所选 择血管的靠近身体的一边，无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾 （建 立一个穿刺的平面的作用 ）,拇指压住所选血管的尾尖端 ，上下夹住 血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜 .（否则容易人为建立 穿刺的角度，而使右手持穿刺针穿刺过深，导致穿刺失败.）右手持穿 刺针，稍微挑起皮肤一*点，就能够平着进针，看到回血表明成功，还能 够回抽，见到回血后表明穿刺已进入血管 ，能够给药.穿刺结束后，用 纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血 .良好并彻底的止血对于血管 能够起到很好的保护作用，这对于需要天天穿刺给药是非常有用的 （一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出血）。如果尾部静 脉注射未能成功，则进行腹腔注射。 瘤细胞饲养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高， 也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。常 见骨髓瘤细胞系有：NS1、SP/0、X63 Ag8.653等。细胞的最大 密度不得超106/ml，一般扩大培养以1 ： 4或6进行稀释传代， 每3?5天可传代一次。上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴 壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 1、 显微镜观察细胞形态，呈较亮表明细胞生长良好，反之颜色较 深，可见一些小黑点，可能细胞已大部分死亡； 2、 状态良好，装入二氧化碳培养箱静置培养 37 C, 5%二氧化碳 浓度，T25细胞培养瓶培养液可加 15ml含10-20%的灭火小牛 血清DMEM培养基进行培养（酒精擦洗，有菌及时擦洗