细胞总蛋白的提取及裂解液.docVIP

细胞总蛋白的提取及裂解液一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000 转×3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF））,离心4000 转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细胞溶解成分。二．裂解缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1％(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)5mM EDTA（现加1ml加10ul）临用前加入蛋白酶抑制剂：Na3VO4钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml)（用0.2mol/L储存液配制）PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml）(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting三．给你介绍一个裂解液：50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含：NaCl 150mM叠氮钠 0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS 上样buffer。四．我的样品蛋白是这样制备的：１．将与腺病毒转染液共培养２４小时的细胞消化下来２．离心收集细胞３．向离心管里加入４０微升１×PBS 缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamilybuffer （由tris碱和SDS 组成）裂解细胞４．将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心．５．测定蛋白浓度，加样电泳我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没问题。五．碧云天公司技术支持Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1%Triton X-100，以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。(-20℃保存，一年有效。)如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量的1/20）加入裂解液。六．军科院技术支持裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/mlPMSF）：1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX－100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF 至终浓度为100ug/ml（0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。七．操作方法：蛋白样品制备：（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于 4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于－20 度保存。