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噬菌体展示载体的构建 中国药科大学 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529 噬菌体展 示载体的构建 吴国球,沈子龙. (中国药科大学生物技术中心，南京210009) 摘要目的构建适宜噬菌体展示的载体系统.方法利用pCOMB3 LacZ强启动 子,Pelb弓I导序列，包 膜蛋白？基因，用NHelXbaI双酶切，切除一个克隆位点；同时设计一对引物，用 PET — 28(a)作模板扩增550bp片 段，插入XhoI — SpcI位点之间,扩增质粒后用限制性内切酶，PCR,DNAM序等方 法作鉴定.结果切除了 272bp NHeI—XbaI片段，插入片段后酶切鉴定显示：XhoI,SpcI单酶切,XbaI,NheI无酶 切；所构质粒用Xhol+SpcI双酶切 及PCFT增均可见550bp片段；测序结果正确.结论成功构建了一种高拷贝，稳 定,多用途,易于操作的噬菌体 展示载体. 关键词噬菌体展示；构建；载体 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000 — 5048(2002)06 — 0529— 04噬 菌体展示文库在新药开发领域,尤其在全人 源化单克隆抗体方面为扩展生物多样性提供了强 大的研究工具［】］.它能容纳超过上白万个单个分子 的克隆，因此乂称全套基因库，可以通过受体与配 体，抗原与抗体相结合的特性，从中筛选出目的基 因克隆，使目的基因能在很短的时间内（数周）高效 克隆，筛选和表达[2].文库的大小是决定生物多样 性的关键.因此构建一种高拷贝,稳定,多用途,易 于操作的载体具有十分重要 的意义. l材料和方法 1.1材料 pCOMB质粒,XL1 — blue菌株（东南大学基础医 学院张建琼博士惠赠）,PET 一 28（a）质粒,JM109菌 株（本实验室保存），限制性内切酶NheI,XbaI, SacI,SpeI,XhoI（Mm）,T4 连接酶,琼脂糖,EDTA, DNA回收试剂盒等（上海生 工）,LB,SOC按常规方 法配制,PCR仪（AmpGene4800），电泳仪（北京六一 仪器厂）. 引物： P1:5-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC 下划线为 XhoI 酶切位点 P2:5-GG 垒！垒!CTAACCAGCACITCAGTGGGAA 下划线为 SpcI 酶切位点 Ck 连宝生物工程公司合成）1.2方法 收稿日期2002— 04—17通讯作者Tel:025 — 3271389 1.2.1pCOMB3的扩增含 pCOMB的XL1 — blue接种于四环素（50mg/L）,氨节宵（100mg/L）双抗平 板,37?过 夜培养，挑单个菌落，接种l0ml的LB液体增菌培养液，37~C6h,摇至ODeo景0.36, 按常规方法抽提质粒：按每毫升菌液l00lI液（50 mmol/LGlucose,25retool/LTris — HC1,l0retool/L EDTA）,200l?液 （0.24mmol/LNaOHl00l, 5SDSl001）,l50l? 液（3mmol/LK.Ac,2.5 mmol/LHAc）混 匀,12000r/min5min,吸取上活 液,等体积酚:氯仿抽提一次，上活液加两倍体积的 无水乙醇,4?放置 10min,12000r/min 离心 5min, 弃上活，沉淀挥十后，加无菌水201, — 20.C保存备 用. 1.2.2片段切除及剩余片段的连接pCOMBs101,加10 x buffer41,去离子水 341,NheI,XbaI 各 1.0 1,37? 酶切 2h,回收片段,201 水溶.取 51 加 10 X 1igation11, 去离子水3.51,T4连接酶0.51,16?连接过夜. 1.2.3感受态细胞制备及转化XL1 一 b1ue单菌落 接种于100m1LB(含氨节背 100mg/L),37?摇至OD600为0.4,8000r/min2min 收集菌液，按每毫升菌 液加 0.5mo1/LCaCI21OOgd,冰上放置 30min,8000r/ min20min,弃上活，沉淀用相同浓度CaC1z悬浮菌 液,1OOp1分装，加10甘油，一 70?保存.取连接液51,加入1OOp1感受态细胞，冰上放置30min,42? 530中国药科大学33卷 热激90s,加入预热SOC1m1,37?摇45min,涂布于 四环素(50mg/L),氨节宵 (100mg/L)双抗平板，同 时设阴，阳性对照,37?过夜，随机挑选单菌落扩大 培养，抽 提质粒，分别用NheI,XbaI,SacI,SpeI, 酶切 检查,0.8琼脂糖100v/50mA电泳 40rain,EB染色，观察结果.阳性质粒命名为Pa. 1.2.4插入片段的制