分子生物学-11-1-第五章基因克隆技术.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 第5章：研究方法-基因克隆 导言：克隆技术 克隆的现代含义 基因克隆 基因克隆策略 基因克隆相关技术 Clone 翻译过来 克隆 “Clone”起源于希腊文“Klone”，原意： 用“嫩枝”或“插条”繁殖。 最初意义 无性繁殖 现代意义 两个词性、三层含义 动词，通过某种操作比如显微操作、分子生 物学操作来获得与某种祖先相同的分子、 细胞、个体的过程。 名词，通过上述操作获得的遗传上与祖先相 同的分子、细胞、个体。 5.5基因文库的筛选 当作名词时，克隆是指由遗传组成完全相同的分子、细胞或个体组成的一个群体。例如， DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷贝； 细胞克隆则是来源于同一祖细胞的、基因型完全相同的一群子细胞； 个体克隆则是指基因型相同的个体的拷贝。 当作动词是指运用DNA重组技术将一个特定的基因或DNA序列输入一个载体分子；也指分离出单个分子、基因或细胞后使之增殖成一个群体，当然也包括复制个体的一系列实验操作。 在分子生物学中特指基因克隆（gene cloning） 指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。 这里面含有几层意思： 1、要知道这个基因的序列如何； 2、要搞清楚这个基因位于基因组那条染色体上，位置关系如何； 3、要把这个基因的序列放置在某种载体分子上以便能够获得它的多个拷贝。 5.5 基因克隆（gene cloning）指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。 基因克隆（gene cloning）是指某种目的基因的分离过程，通常是从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA片段，再通过DNA 序列扩增形成由众多拷贝组成的DNA拷贝群体的过程。 几层意思： 1、要知道这个基因的序列如何； 2、要搞清楚这个基因位于基因组那条染色体上，位置关系如何； 3、把这个基因的序列放置在某种载体分子上以便能够获得它的多个拷贝 基因克隆的一般策略 1 已知序列基因的克隆 概述： 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession　number),以便别人参考和查询 已知序列的来源 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL, Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。 目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。 查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。 2 表型或功能克隆 1、定义 表型克隆（phenotypic cloning）或者称为功能克隆（functional cloning）、差异基因克隆。 从功能出发，利用特定组织细胞器官与正常组织细胞器官DNA或RNA水平上的差异，进行相关基因的分离与克隆，这些基因表达变化是与可检测的表型变化直接联系的，故称为表型克隆，这些表型变化又是与某种生理功能紧密相关的，所以又称为功能克隆。 产物已知基因的功能克隆方法 （适用于产物和功能已知的基因） 寻找表型异常 找出导致表型异常的 异常功能蛋白