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酶标记和免疫层析法技术 黄陂区人民医院  酶联免疫吸附测定法(ELSA) 今1、1简介:基本概念: 抗原:抗原是指进入人或动物机体后,可刺 激机体免疫系统发生免疫应答,从而引起动物 产生抗体或形成致敏淋巴细胞,并能和抗体或 致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。  抗体:是由抗原刺激动物的免疫系统后,由 免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性 结合的免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性:a、反应的特异性;b、 反应的等比例性  1.2、ELSA方法简介 今ELSA属于标记免疫学技术的一种,1971年由 荷兰和瑞典的学者提出,由于其操作过程简单 易行并可以定量,从而使其在医学检验中得到 了广泛的应用  13、ELSA方法的原理 基于抗原抗体反应的特异性和等比例性,以聚苯乙烯塑料微 孔板为载体,在适当的技术条件下使抗原或抗体包被(吸附) 在酶标板微孔的内壁上成为包被抗体或抗原,没有被吸附的 抗原或抗体通过洗涤除去,然后直接加入酶标记抗体或抗原 形成酶标记的抗原一抗体复合物固定在微孔内,没有吸附的 酶标记物洗涤去除,在微孔中加入底物溶液,复合物上的酶 催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。复合物上 酶的量和酶产物呈现的色泽成正比,因此可以用酶标仪进行 测定,从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。  今14、ELSA方法的分类 ELSA可以分为直接法、间接法和夹心法等几 种 直接法: 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标 板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原一抗体复 合物,加入酶反应底物,测定产物的吸光值, 计算岀包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图 2-17(a)  间接法 ◆是将酶标记在二抗上,当抗体(一抗)和包被在酶标板的抗 原结合形成复合后,再以酶标二抗和复合物结合,通过测定 酶反应产物的颜色可以反应一抗和抗原的结合情况,进而计 算出抗原或抗体的量。见图2-17(b) 夹心法 令是先将未标记的抗体包被在酶标板上,用于捕获抗原,在用 酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物;也可 以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合 形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物,见图2-17(C)。前者 称为直接夹心法,后者称为间接夹心法。  ELSA原理及分类(图217) ①抗体包被 l、x小*+平 ②抗原包被 )问接法 ▲▲▲▲▲ 人人人人人 ①直接夹心法丫丫 ②间接夹心法 代表抗质↓代表框标抗丫代表抗体大代表标沉体员代表产物 图2-17 ELISA原理图 引自于善谦等  今上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。下面对 接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。 在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测 定孔和对照孔,在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标 记物;在测定孔中同时加入酶标记物和非酶标抗原(通 常来自于待测样品),酶标记物和样品互相竞争包被抗 体的结合点,经过温浴后,没有结合到包被抗体上的酶 标记物和样品经过洗涤去除。拍干后加入底物溶液,经 温育后洗涤拍干,显色、终止,用酶标仪测定吸光度值。 其反应原理如(图2-18)  竞争法ELSA原理(图218) YYYYY 酶标记物 底物溶液 ◇◇◇ ◇◇◇◇