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牙髓间充质干细胞生产 I ． 目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。 II ． 范围： 适用于牙髓间充质干细胞的生产； 适用于技术部和各中心技术组 的所有技术人员。 III ． 职责： 1. 生产主管负责本制度的执行和监督； 2. 技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 3. 监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和 《生产试剂耗材记录表》。 附表 1 牙髓 / 骨髓 / 脂肪 / 胎盘 / 脐带间充质干细胞生产记录 附表 2 生产试剂耗材记录表 IV ． 规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1. 仪器耗材 1）10ml 移液管 2 ）培养皿 3 ）50ml 离心管 4 ）100μm筛网 5 ）T75 培养瓶 6 ）15ml 离心管 2. 试剂 1）生理盐水 2 ）培养基 3 ）胶原酶 3. 酶消化法操作流程 3.1 将浸在含 1%双抗的生理盐水中的牙齿取出， 吸取运输液 4ml 交给质检，并 填写《样本取样单》 ，牙齿置于 75%酒精中浸泡 30min； 3.2 取出牙齿在含 10ml 生理盐水的培养皿中清洗 2-3 遍，用止血钳固定牙冠， 持骨钳夹碎牙根部， 暴露出牙髓， 用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培 养皿中； 3 3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成 1mm ，转移到 50ml 离心管中，加入生理盐水至 30ml, 再加入 10ml 0.2%胶原酶； 3.4 置于 37℃恒温摇床， 180rmp消化 30min ； 3.5 用 100μm滤网过滤； 3.6 1200 rpm 离心 10min ，吸取洗涤液 4ml 交给质检，并填写《样本取样单》 ； 附表 3 样本取样单 7 2 3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为 10 /ml, 置于 75cm 培养瓶中 , 放入 37℃，CO2 培养箱中进行培养。 4. 组织块法操作流程： 4.1 将浸在含 1%双抗的生理盐水中的牙齿取出， 吸取运输液 4ml 交给质检，并 填写《样本取样单》 ，牙齿置于 75%酒精中浸泡 30min； 4.2 取出牙齿在含 10ml 生理盐水的培养皿中清洗 2-3 遍，用止血钳固定牙冠， 持骨钳夹碎牙根部， 暴露出牙髓， 用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培 养皿中； 3 4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成 1mm ，将组织块均匀铺到 T25 培养瓶（用适量 FBS润湿瓶底）瓶底； 4.6 倒置培养瓶，并加入 5ml 培养基，放入培养箱中培养； 4.7 12-24h 后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。 二、牙髓间充质干细胞换液 1. 耗材 1）10ml 移液管 2 ）15ml 离心管 2. 试剂 培养基 3. 操作流程 3.1 镜下观察状态细胞； 3.2 吸取上清液 4ml 交给质检，并填写《样本取样单》 ； 3.3 吸取上清液于 50ml 离心管中留作精华液 （原代培养上清不留），并补充新的 培养基； 2 3.4 观察细胞并将其置于 37℃，5%CO孵箱中培养。 三、牙髓间充质干细胞传代培养 1. 耗材 1）10ml 移液管 2 ）50ml 离心管 3 ）培养瓶 4 ）15ml 离心管 2. 试剂 1）生理盐水 2 ）胰酶 3 ）血清 4 ）培养基 3. 操作流程 3.1 显微镜观察，观察培养瓶中的细胞密度到达 80%—90%，可进行传代培养； 3.2 吸取上清