蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法).pdf

. 一）实验原理 双缩脲 （NH3CONHCONH3）是两个分子脲经 180℃左右加热， 放出一个分子氨后得到的产物。 在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基 或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关， 故可用 来测定蛋白质含量。 测定范围为 1~10mg 蛋白质。 干扰这一测定的物质主要有： 硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近， 以及干扰物质少。 主要的缺点是 灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（ BSA）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 BSA浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋 白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量， 计算出其纯度， 再根据其纯度， 称量配制 成标准蛋白质溶液。 牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制， 酪蛋白用 0 ．05N NaOH 配制。 （2 ）双缩脲试剂：称以 1.50 克硫酸铜（ CuSO4?5H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠（ KNaC4H4O6? 4H2O ），用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH溶液，用水稀释到 1 升，贮 存于塑料瓶中 （或内壁涂以石蜡的瓶中） 。此试剂可长期保存。 若贮存瓶中有黑色沉淀出现， 则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管 15 支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取 12 支试管分两组，分别加入 0 ，0.2，0.4 ，0.6， 0.8，1.0 毫升的标准 蛋白质溶液， 用水补足到 1 毫升，然后加入 4 毫升双缩脲试剂。 充分摇匀后， 在室温 （20~25℃） 下放置 30 分钟， 于 540nm 处进行比色测定。 用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照 液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2 、样品的测定：取 2~3 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样 品浓度不要超过 10mg/ml 。 三、 Folin—酚试剂法（ Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。 过去此法是应用最广泛的一种方法， 由于其试剂乙 的配制较为困难（现在已可以订购） ，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以增加显色量，从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是： ?在碱性条件下，蛋白 质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨 酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物） 。在一定的条件下，兰色深度 与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。 以后在生物化学领域得到 广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高， 比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要 精确控