蛋白质定量：(BCA法).pdf

. 实验原理 BCA(bicinchoninic acid) 是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离 子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和 BCA 相互作用，两分子 的 BCA 螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在 562nm 处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关 系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在 562nm 处的吸光度计算待测蛋白 浓度。 实验准备 1. BCA 定量试剂盒：含 A 液和 B 液 A 液： BCA 碱性溶液（配方： 1%BCA 二钠盐， 0.4% 氢氧化钠， 0.16% 酒石酸 钠， 2% 无水碳酸钠， 0.95% 碳酸氢钠，这些液体混合后再调 PH 至 11.25 ） B 液： 4% 硫酸铜 2.牛蛋白血清（ BSA ） 3.待测的蛋白样品 实验步骤 1 / 4 . 1.配置 BCA 工作液：将 A 液和 B 液摇晃混匀，按照 A:B=50:1 的比例配置 BCA 工作液，充分混匀。（ BCA 工作液室温下 24h 内稳定，故现用现配） 2. 配置不同浓度的标准蛋白液（ BSA ）， 1ug/ul ，2.5 ug/ul ，5 ug/ul ， 7.5 ug/ul ，10 ug/ul ，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液 （如待测样品溶于强 RIPA 裂解液，则用强 RIPA 裂解液来稀释标准蛋白 液）。 3.取空白组（ 0ug/ul BSA ）各浓度的标准蛋白液 5ul 加入 96 孔板中，另取待测 的蛋白样品 5ul ，加入 96 孔板。 PS ：上图加样的量仅作为参考，蛋白液和 BCA 工作液的比例符合即可。 4. 向各孔的蛋白液中加入 300ul 的 BCA 工作液，混匀， 37 度放置 30 分钟， （加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。 PS ：温度和放置时间可以 调整，可在 60 度放置 30 分钟 or 室温放置 2 小时。 5.静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定 562nm 出的吸光度，并制作标准曲 线。 2 / 4 . 6.根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。 注意事项 BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温 度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育 or 延长孵育时间。 标准蛋白液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出 现偏差，影响待测样品的浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置 标准蛋白液，另一方面应使用精确度高的移液枪。 A 液和 B 液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀，最后可见透明溶液。 为加快 BCA 法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但切勿过热。 当结果出现空白组本身就有较高的背景，可用 Bradford 法重新测定蛋白浓度。 优缺点 优点： 测定快速简便， 45 分钟内完成 准确灵敏 ,检测浓度为 5-200 mg/ml 干扰物质少， BCA 法不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响，可兼容样品 中高达 5% 的 SDS ，5%Triton X-100,5% 的 Tween