蛋白酶活性测定方法.pdf

. 水 产 动 物 酶 活 性 测 定 方 法 一 、分析样品的采取与处理 每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重 ,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏 ,测定肠道长度， 剔除脂肪组织，用 4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入— 26 ℃冰箱中 迅速冷却保存，供测酶活性用。 二、 酶液的制备 将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食 靡 0.5g ，放入离心塑料管中， 加 4ml ，4 ℃冷却去离子水稀释， 4℃下离心 20min （13，000g ）， 上清液标号分装，并与 4 ℃冰箱中冷却保存， 24Hr 待测。 将肝胰脏及肠道组织用 4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各 1.0g。按样品重量加 10 倍的 4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆 4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴） 。匀浆液在 4℃下离心 20 分钟 （13，000g），上清液标号分装， 并于 4 ℃ 冰箱冷却保存， 24Hr 内测定完毕。 酶粉及饲料： 取 2 ．0 克酶粉，先用 10 倍 PH7.0 缓冲液溶解，并放在 40 ℃水浴中恒温 30 分钟，过滤 留置滤液待测。测定前再稀释 10 倍， 20 倍， 100 倍 即可。 取 2.0 克饲料， 加 PH7.0 缓冲液 20ml 溶解 , 并放在 40 ℃水浴中恒温 30 分钟， 过滤留置 滤液待测。 三、酶活性测定 1. 蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。 方法：福林—酚试剂法 1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（ TCA ）的氨基酸（如酪 氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ，这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应） ，用 分光光度计测定。 1.2 蛋白酶活性单位： 1 克食靡或组织在 30℃，PH 在 7.0 的条件下， 每分钟水解酪蛋白产生 1 微克酪氨 酸的酶量为 1 个酶活力单位。 1.3 试剂 1. 福林试剂（已配） 2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（ Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至 1， 000ml ，存放与具胶塞的试剂瓶中。 3. 0.1M 三氯醋酸（ TCA ）：用小烧杯称取 65.4g 三氯醋酸，加水溶解后定容为 1，000ml 。 4. L—酪氨酸。 5. 缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。 A ：0.2mol/L KH2PO4 (ml): 50; B ：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63 C ：水（ ml ） 120.37 PH （20℃）： 7.0 6 ．酪蛋白溶液：精确称取酪素 2.000g ，先用少量 0.5N 氢氧化钠浸润后，加入 少量缓冲液， 在沸水浴中加热， 经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解， 冷却 后移入 100ml 容量瓶中，并用相应的缓冲液定