PCR扩增的原理和操作步骤[参考].pdfVIP

PCR 扩增反应的操作 第一节 PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组 DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增 DNA 片段的一种技术，在 分子生物学中有广泛的应用，包括用于 DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链 DNA 为模板，4 种 dNTP 为底物，在模板 3’末端有引物存在的情 况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩增。在 微量离心管中，加入与待扩增的 DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、 微量的 DNA 膜板、四种 dNTP 溶液、耐热 Taq DNA 聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热， 使模板 DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与 其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化 下，以 dNTP 为原料，引物沿 5’→3’方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反 应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使 目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定 DNA 聚合酶在适当温度下催化 DNA 链延伸合成（见图）。 1．模板DNA 的变性 模板 DNA 加热到 90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为 DNA 的变 性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与 DNA 中 G-C 含量有关，G-C 间由三个 氢键连接，而 A-T 间只有两个氢键相连，所以 G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。 故 PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板 DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有 关。对于高 G-C 含量的模板 DNA 在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO ），并且在PCR 循 环中起始阶段热变性温度可以采用 97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2 ．模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至 37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成 DNA 模板-引物 复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一 般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在 退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火 时间一般为 1～2min 。 3 ．引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板 DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三 过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要 的时间取决于模板DNA 的长度。在72℃条件下，Taq DNA 聚合酶催化的合成速度大约为 40～60 个碱基/秒。经过一轮 “变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中， 新合成的 DNA 都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个 循环需 2～4min ，一次PCR 经过 30～40 次循环，约 2～3h 。扩增初期，扩增的量呈直线上升， 但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的 “平台效应” ，即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行，使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 n Y ＝（1＋X ） 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平（Y ）均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应 初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不 0 再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现 “停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩