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cy 染料小动物活体成像操作流程 2017/4/13 吲哚花菁绿 (ICG， indocyanine green)是经过 FDA 认证的菁染料，出于安全 考虑，后期应用于活体(人、动物、细胞)的染料在结构上都和 ICG 有相似或 相近之处。 cy 系列染料是 Amersham公司(目前为 GE 公司)最初开发的染料体 系，它的桥环由苯并吲哚变为吲哚环， 并在吲哚的苯环上对称地引入硫酸根基团， 水溶性得到很大改善，分子量降低后对大分子的亲和力有所增加。 cy 系列菁染 料多带有羟基琥珀酰亚胺活性酯 (NHS ester)、异硫氰酸酯 (NCS)等活性基团，可 与蛋白质、多肽、 DNA 或其他生物分子中的羟基、氨基或巯基以化学键的方式 键合，表征生物分子的特性， 形成具有生物功能的标记衍生物， 广泛被用于抗体、 多肽、小分子等多种荧光探针的合成中， 可以说是目前使用最为广泛的一类近红 外染料。 cy 染料应选择 GE、李记生物等公司产品，化工企业提供的 cy 染料产 品，一般不作为活体成像使用。 一、Cy 染料在活体成像的应用领域 标记特异性抗体 在 CY 菁染料标记蛋白的研究中， 除了牛血清白蛋白以外最先开始涉及的功能性 物质是抗体。从起初与 IgG 结合，用荧光光纤免疫传感器 (FFOI， fluorescent fiber-optic immunosensor)考察抗原抗体反应，到现在连接特异性的单克隆抗体片 段，对动物全身进行免疫荧光显影，分析片段在体内的分布代谢情况。分析 cy- 抗体复合物在不同时间不同器官中的荧光强度变化， 可对抗体的靶向性、 清除率 等有更直观的评价。 不过，染料抗体衍生物在降低背景噪音和非特异性吸附方面 还有待进一步完善。 标记特异性多肽 (Conjugating to peptides) 在肿瘤诊断和治疗中， 与菁染料衍生物结合的多肽主要有两种： 其一是针对肿瘤 表面过量表达的受体； 另一种则针对肿瘤相关酶类。 前者的报道很多， 如生长激 素抑制素、 表皮生长因子， 甚至一些特殊设计过的短肽， 都可以被用来靶向结合 肿瘤，现在更趋向于一些只有十几个氨基酸的环肽， 因为它分子量小易于接近肿 瘤部位，且呈环状构形不易被分解。 Cy 系列染料均能利用自身携带的活性基团 直接与环肽结合， 部分此类探针检测发现， 在近红外光学显影和放射显影在浅表 的分辨率相似， 但在深层组织中前者的信噪比更高。 针对酶类研究一般是设计酶 特异性荧光探针，这种与 Cy 系列染料结合的检测技术除了在体内定位时有显著 优势外，亦可作为体外检测手段与一些常用技术结合， 辅助确定组织中该酶的存 在。 与药物载体结合 （Conjugating to drug carriers） 现在生物可降解的、 靶向性高的载体是药学制剂领域的一个研究热点， 而近红外 染料为研究这些载体的体内行为提供了一种新思路。 这些载体主体一般是由多聚 谷氨酸、 PGC 等多聚物组成的骨架，骨架侧链上有很多活性基团，可以同时连 接上数个靶向功能模块和染料分子， 所以在装载药物之前就可以先利用荧光显影 对该载体的靶向性等作出评价。 这个领域的报道比较少， 现在多选用结构较小的 单克隆抗体片段或叶酸这些小分子作为药物载体上的靶向模块与 Cy 系列染料、 ICG 衍生物等结合， 进一步完善对这些载体的研究可以为疾病确定和定位给药带 来新的希望。 二、 cy染料活化基团的选择 依需要标记的抗原、抗体、酶、多肽等分子所带的可标记基团的种类（氨基、醛 基或巯基） 以及分子的酸碱性， 选择相应的活化染料和反应条件。 为减少空间位 阻影响，可在 cy 染料与被标记物之间加入交联臂结构。常见抗体、抗原、酶、 多肽对应的染料活化基团如下： 标记氨基的活化基团： NHS ester （N-羟基丁二酰亚胺酯 ）。 标记醛基的活化基团： Hydrazide 酰肼。多的用于神经元细胞的电极失踪和神 经缝隙连接研究 标记巯基的活化基团： Maleimide ，马来酰亚胺 三、小动物活体成像操作流程 以研究肿瘤靶向信号肽为例， 介绍小动物活体成像实验流程。 本实验人工给小鼠 接种皮下肿瘤，然后制备 cy7-信号肽复合体（探针），通过尾静脉注射小鼠，在 不同时间点做活体成像分析， 观察 cy7-信号肽复合体 （探针） 在体内的特异性分 布。 实验动物准备（动物模型建立） 1） SPF级 BALB/C 裸鼠， 5～ 8 周龄， 18～20 克，自由进食、水。饲养 1 周后 接种细胞，分组或混编分笼饲养。 12小时光照 /日,明暗交替。相对湿度 50%±10%、 温度 23±2℃。 2） 细胞培养瓶中培养 CNE-1 细胞（实验室根据具体情况），取对数生长期，胰 酶常规消化 ,离心，富集，利用无菌