中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)实验室检测ppt参考课件.ppt

upE upE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3 upE-Rev 5-GCCTCTACACGGGACCCATA-3 upE-Prb 5FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3 ORF1b ORF1b-Fwd 5-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3 ORF1b-Rev 5-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3 ORF1b-Prb 5FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3 ORF1a ORF1a-Fwd 5- CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3 ORF1a-Rev 5- CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3 ORF1a-Prb 5FAM- TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3 N2 N2-Fwd 5- GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3 N2-Rev 5- TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3 N2-Prb 5FAM- ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3 分子检测引物与探针 * * Y=-3.56x+39.19 R2=0.988 1e6 1e4 1e3 1e2 * * 荧光定量RT-PCR检测结果判断 阴性: 无Ct值或Ct为40。 阳性：Ct值37, 可报告为阳性。 Ct值在37-40之间的样本建议重做, 若重做结果Ct值 37，该样本判断为阳性, 否则为阴性。 * * MERS-CoV核酸检测结果报告 在实验室要确认一个样本为阳性，需要满足以下两个条件的其中一个： 至少两种MERS-CoV特异性PCR结果阳性； 一种PCR结果为阳性，另外一种PCR产物序列测序，与MERS-CoV序列相符。 当针对MERS-CoV的两种不同的检测方法结果不一致的时候，应当采用反转录PCR扩增，对扩增产物进行测序以确认检测结果。 * * 检测结果判读 阴性结果也不能排除临床病人的感染，一些因素可能产生假阴性，包括： 样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本； 样本收集的过早或过晚； 没有正确的保存、运输和处理样本； 技术本身存在的原因，如病毒变异，PCR抑制等。 当PCR检测结果为阴性，但临床表现和流行病学特点提示是MERS-CoV感染时，可采用血清学方法进行检测。双份血清标本能够满足血清学检测的要求。 * * 我国首例输入性中东呼吸综合征病例的实验室快速确诊 2015年5月27日晚10时世界卫生组织向中国卫生计生委通报，韩国1例确诊中东呼吸综合征（MERS）病例的密切接触者经香港入境广东省惠州市。 5月28日下午，经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检测，初筛结果为阳性。 样本接收时间：2015.5.29日凌晨1点40分（中国疾控中心病毒病所） 实验室确诊结果上报： 2015.5.29日凌晨5点40分 * * 疑似MERS-CoV感染的实验室快速确诊 样本来源：KIM MYEONGSHIK (韩国）广东省惠州市 样本类型：鼻咽拭子(3份） 血清(1份） 采样日期：2015.5.28 实验室复核检测流程： BSL-3实验室：分装灭活 BSL-2实验室：核酸提取 荧光定量RT-PCR (三个靶标UpE、ORF1b和N2) 结果判定与报告 * 2020/3/15 广东省CDC疑似MERS-CoV感染的复核检测 UpE检测扩增曲线 ORF1b检测扩增曲线 N2检测扩增曲线 * * 靶标 鼻咽拭子 血 （－） （－） （－） （＋） 1 2 3 UpE 34.18 33.9 33.84 No Ct No Ct No Ct No Ct 25.51 ORF1b 35.85 35.16 34.73 No Ct No Ct No Ct No Ct 27.95 N2 31.21 31.27 30.76 36.5 No Ct No Ct ND 21.34 疑似MERS-CoV感染的送检样本复核检测 荧光定量RT-PCR检测结果（Ct 值） * 结论 采用upE/ORF1b/N2 三个靶标，进行三种荧光定量RT-PCR扩增，在对照成立的基础上，三管咽拭子样本检测结果皆为阳性。 基于N2靶标的荧光定量RT-PCR扩增，血清标本呈弱阳性。 结论：广东疑似MERS-CoV病人实验