蛋白质检测原理.docVIP

蛋白质是含氮的有机化合物。 食品与硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解， 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。 然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和  CuSO4 ，浓  H2SO4  作用下，硝化生成（  NH4 ）2SO4 反应式为： 2NH2+H2S04+2H ＝（ NH4 ）2S04 （其中 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出  CuSO4 做催化剂） NH3 ，收集于  H3BO3  溶液中 反应式为： NH4 ） 2SO4+2NaOH ＝ 2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3 ＝（ NH4 ） 2B4O7+5H2O 3. 用已知浓度的 H2SO4（或 HCI ）标准溶液滴定， 根据 HCI 消耗的量计算出氮的含量， 然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量 反应式为： NH4 ） 2B4O7+H2SO4+5H2O ＝（ NH4 ） 2SO4+4H3BO3 NH4 ） 2B4O7+2HCl+5H2O ＝ 2NH4Cl+4H3BO3 消化 根据样品量的多少选择适宜的凯氏烧瓶 4 个（此处以 50 毫升为例），其中 2 个为对照。 向烧瓶内加入准确称量的样品， 注意要把样品加至烧瓶底部， 切勿沾在瓶口及瓶颈上。 另外 个作空白对照，好对样品进行校正。 在每个烧瓶中加入约 300 毫克硫酸钾 -硫酸铜混合物（硫酸钾：五水硫酸铜 =3 ：1、6：1 或 10： 1 均可），再用量筒加入 3 毫升浓硫酸。将上述 4 个凯氏烧瓶放在通风良好处（最好 在通风橱中进行）加热消化。先用小火加热至沸腾。此时会产生大量泡沫， 应特别注意不能 让黑色物质上升到烧瓶颈部， 否则将严重影响分析结果。 当混合物停止冒泡， 蒸汽与二氧化 硫也均匀地放出时， 将火焰调节到保持瓶内液体微微沸腾。 假若发现瓶颈上有黑色颗粒， 应 小心地将烧瓶倾斜振摇， 用消化液将其洗下。 在消化过程中要时常转动烧瓶， 使全部样品都 浸在消化液中。 当消化液呈清澈淡蓝色时即告消化结束。 时间一般在 5~6 小时！若样品中含 赖氨酸或组氨酸较多时， 消化时间需要延长 1~2 倍。因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全。 蒸馏 采用改良式凯氏定氮仪。 1、洗涤蒸馏仪：用硼酸指示剂（取 100 毫升 2%硼酸溶液，滴加混合指示剂约 1 毫升， 摇匀后呈紫红色即可；混合指示剂： 50 毫升 %甲烯蓝乙醇 +200 毫升 %甲基红乙醇，存于棕色瓶中）检测是否清洗干净。干净标准：指示剂不变色。 2、样品和空白的蒸馏：取 2 毫升稀释消化液至加样口加入反应室，关闭加样口，另取 1 个装硼酸指示剂的三角瓶接于冷凝管下端。取  30% 氢氧化钠（  W/W ）溶液约  10 毫升，从 加样口缓慢加入，当未加完时关闭，并加入约 3 毫升蒸馏水，再继续缓慢加入一半后关闭，让剩下的水作液封。 将加热器重新放在蒸汽发生器下加热 （注：在清洗仪器完毕后应拿走加热器），待三角瓶中液体由紫红变成鲜绿色起开始计时，蒸馏 5 分钟，然后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约 1 厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周， 继续蒸馏 1 分钟。空白同样。 3、清洗仪器：同上，不必用指示剂。 滴定 用 L 标准盐酸（要标定，费时）滴定三角瓶中收集的氨，直至硼酸指示剂由绿变紫红。 凯氏定氮仪原理及操作步骤 凯氏原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。 食品与硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解， 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 有机物中的胺根在强热和 CuSO4，浓 H2SO4 作用下，硝化生成 (NH4)2SO4 反应式为： 2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 ( 其中 CuSO4做催化剂 ) 2. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中 反应式为 : (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 3. 用已知浓度的 H2SO4(或 HCI) 标准溶液滴定， 根据 HCI 消耗的量计算出氮的含量， 然后乘以相应的换 算因子，既得蛋白质的含量 反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 操作步骤： ( 一 ) 消化 、准备 6个凯氏烧瓶，标号。 1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液，样