感受态细胞的制备步骤及原理.docxVIP

实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1 挑取一个 JM109 单菌落于 3ml LB(无抗生素 )培养基中， 37℃，180rpm 培养过夜。 [ 让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。 ] 2 取过夜培养物加入到 40mL LB(无抗生素 )培养基中， 37℃250rpm 大约小 时。 [ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。 ] 3 取培养物置于 40mL 的灭菌离心管中，冰浴 10min，4000rpm4℃ 离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [ 使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。 ] 4 菌体重悬于 10mL100mmol/L 冰冷 CaCl2中，轻吹， 4℃ 30min，4000rpm离心 5min 弃上清。 [ 细菌处于 0 度， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源 DNA形成抗 DNA 酶的羟基 -钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于 DNA），经短时间 420C热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。（一 1 / 3 定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱） ]5 菌体重悬于 1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [ 除去所有的 LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以 致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱） ] 6 取感受态细胞 100uL，加入 2uLpET-21a质粒，冰浴 30 min 受体菌：感受态细胞 100uL，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照： LCaCl2溶液 100uL，加入 2 uL 阴性对照 [ 第一个阴性对照是为了验证 LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证 CaCl2溶液和 pET-21a质粒未被污染。 ] [ 冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。 ] 7 热激 42 度， 90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】 8 冰浴 2 min 9 加入 800 uL无抗生素的 LB，37℃ 复苏 1h 【用 LB 复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生 素的 LB平板上生长。】 10 取 100ul 细胞直接在含 50ug/mLCarbenicillin(羧苄西林 )的 LB培养基上铺平板，将平皿放置 37 oC温箱 30min 至液体被吸收。倒置平皿 37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。 2 / 3 因为抗生素高温易失活，所以应等到 LB600C时（热而不烫），加入抗生素。】 3 / 3