ELISA双抗夹心法检测抗原学习资料.pptVIP

样本的制备与保存： 血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4℃，超过一周，-80℃保存； ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清： 分别于活化后不同时间点收集培养的细胞，2000rpm，4℃离心分离上清，冰上放置，分装 课件 试剂的准备 ELISA 中用的蒸馏水或者去离子水，包括用于配置coating buffer，稀释Assay buffer，洗涤的，应为新鲜的和高质量的； 从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用； 试剂最好现配先用 课件 固相载体 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能； 国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式； 已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。 课件 包被 定义：将抗原或者抗体固定在固相载体的过程称为包被； 物理吸附：两者的疏水基团通过疏水键的作用 抗体或者蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液（即本次实验用的coating buffer） 4-8℃包被过夜(有利于蛋白活性的保持），与37℃孵育2小时被认为具有相等的包被效果 包被的最适当浓度随着载体和包被物的性质和酶结合物的浓度调定 课件 封闭 定义：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程； 目的：抗原或抗体包被时所用的浓度比较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量的不相关蛋白质填充这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附； 常用封闭液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脱脂奶粉； 本实验用封闭液：1×Assay buffer。 课件 加样 ELISA中一般有3次加样步骤，即，加样本（和/或标准品），加酶结合物，加底物； 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以溅出,不可以产生气泡； 多道加液器的使用 课件 孵育(温育） 在ELISA中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温的过程称为孵育； 常用温度：43℃，37℃，室温，4℃等 孵育时为了避免蒸发，可以用塑料封口胶或者保鲜膜封板 课件 洗涤 洗涤在ELISA中虽然不是一个反应步骤，但决定了实验的成败 聚苯乙烯等塑料对蛋白的吸附是普遍的，洗涤可以清除在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质 洗涤可以清除残留在板孔中没有能够与固相抗原或者抗体结合的物质 常加入非离子表面活性剂（含有疏水基团+亲水基团），以抑制蛋白质吸附于塑料表面，如吐温20，0.05%的浓度比较合适，浓度＞2%会洗脱包被在板上的抗原或者抗体 课件 洗涤方式： 甩干孔内的反应液 浸泡，即将洗涤液注满板孔(约300μl），静置3min，浸泡时间不可以随意缩短； 甩去液体后在吸水纸上拍干 重复操作2，3，洗涤次数按要求操作 课件 显色和比色 显色是ELISA中的最后一步孵育反应，此时，酶催化无色的底物生成有色的产物； 定量实验中，加入底物后的反应温度和时间应该按规定力求准确；定性测定的显色时间一般不需要严格控制和及时判断； 终止反应，防止反应过度： TMB受光照影响不大，经HRP作用后，40min达到高峰；终止液有多种，叠氮钠或SDS等酶抑制剂可以维持蓝色12-24h不褪色； OPD受光照会自行变色，要避光，经HRP作用后，37℃孵育20-30min后颜色即不再加深；常用终止液为2M H2S04； 课件 HRP的色原底物系统 与HRP反应后的颜色 加终止液后的颜色 读数波长 特 点 OPD 临苯二胺 492nm 致畸， 但本底好 TMB 四甲基联苯胺 450nm 操作方便， 本底较高 课件 ELISA 数据的处理 根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程 将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度 课件 Protocal 包被：用Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ，100ul/孔，湿盒4℃过夜； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，3×3min，控干； 封闭：加1×Assay diluent 200ul/孔，37℃避光孵育2h； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 5. 加样：100ul/孔，37℃避光孵育1h ； 6. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 7. Biotin-Detection Ab: 用1×Assay diluent 1:1000 稀释detection Ab ，100ul/孔， 37℃避光孵育1h； 8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 9. Avidin-HRP: 用1×Assay diluent 1