分子生物学实验课件 6PCR扩增产物鉴定与纯化.pptVIP

课件作者：蒋华云 PCR扩增产物的鉴定与纯化 * 实验目的 通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 对获得的目的产物进行割胶纯化回收,为接下来的DNA重组和转化实验提供外源DNA片段。 实验原理 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 TaKaRa公司的胶纯化试剂盒 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段的试剂盒，采用了独特的凝胶溶解bufffer，其具有较强的缓冲性能并含有pH指示剂，方便判断溶液的pH是否适合与DNA制备膜结合，其溶胶能力很强，无需加热，再室温（15-25度）条件下即可快速溶胶。结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便的特点，全套操作只需20min便可完成。使用该试剂盒每次可纯化得到多至20μg的DNA片段（50bp～20kb），回收率高达50～80%。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。 经胶纯化试剂盒回收的DNA片段采用-20℃低温保存，延缓DNA的降解。 仪器、材料与试剂 【仪器】 琼脂糖凝胶电泳系统 紫外透射仪 台式离心机 移液枪（配套枪头） -20℃低温冰箱 分析天平 【材料与试剂】 PCR扩增产物 Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa) 琼脂糖 1×TAE 6×Loading Buffer DNA Marker 2000 单面刀片 纯化试剂盒 1.5mL离心管 超纯水（无菌） 实验步骤 （1）使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验） （2）在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。 注意：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 实验步骤 （3）切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。 （4）称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μL进行计算。 （5）向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表： （6）均匀混合后15-25℃融化胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。 注意：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 （7）*当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。 （8）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 （9）将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1min，弃滤液。 注意：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。 （10）将700 μL的Buffer WB加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。 （11）重复操作步骤10。 （12）将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 μL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。 注意：使用加热至60℃的灭菌蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。 （13）室温12000 rpm离心1min洗脱DNA。 （14）-20℃低温保存纯化的目的DNA片段。 实验分组 PCR产物鉴定 全班分为2大组，每大组制备1块1%的琼脂糖凝胶。（8个点样孔，1孔Marker,7孔样品。） 割胶纯化回收目的DNA片段 每4人1组（检测到PCR反应产物的），全班约7组。 思考题 为什么PCR扩增得到的目的DNA片段不宜直接用于连接反应，采用什么方法纯化目的DNA片段可提高连接效率？ 纯化的目的DNA片段应如何保存？ 电泳图 * （1）使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验） （2）在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。 注意：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 （3）切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。 （4）称量胶块重量，计算胶块体