分子生物学实验课件 7大肠杆菌感受态细胞的制备.pptVIP

2015年3月 课件作者:蒋华云 大肠杆菌感受态细胞的制备 * * 什么是感受态？ 宿主 大肠杆菌（E. coli DH-5α） （R-，M-，Amp-） 感受态 细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态 2012-4-16 课件作者:蒋华云 实验目的 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法和技术。 为接下来的DNA重组与转化实验提供感受态细胞。 实验原理 处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。 细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。 实验原理 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。 实验原理 转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 实验原理 进入受体细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞)。 实验原理 目前常用的感受态细胞制备方法 CaCl2法 CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法使用广泛。 RbCl(KCl)法 仪器、材料与试剂 【仪器】 超净工作台 冷冻离心机 恒温摇床 －70℃冰箱 1mL、200μL移液枪（配套枪头） 10mL移液管 吸耳球 100mL 离心管 1.5mL小指管 【材料与试剂】 大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-） LB液体培养基 0.1mol/L CaCl2溶液 30%甘油 实验步骤 （一）受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。 将该菌种悬液以1:100的比例接种，取500μL菌液转接到50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600 ＝0.5左右。 实验步骤 （二）感受态细胞的制备 （注意：以下操作在超净工作台完成。） 将菌液转入100mL离心管中，冰上放置10min。 在4℃下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。 用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。 0～4℃ 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。 （注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备） 实验步骤 （三）感受态细胞的分装与冻存 在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）,轻轻混匀。 将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL小指管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。） 实验分组 全班分为2大组，每大组培养50mL菌液，最后每人制备得到1支200μL的感受态细胞，全班至少保存32支感受态细胞。 另外，没有到超净工作台操作的学生可以在实验室进行小量感受态的模拟制备。（非无菌条件下，制备完成后不保存。） 思考题 怎样制备大肠杆菌感受态细胞？如何获得适合用于制备感受态的菌体细胞？ *