FITC-AnnexinVPI双染色法检测凋亡细胞的.docxVIP

细胞生物学实验 细胞生物学实验 PAGE PAGE # FITC-AnnexinV/PI 双染色法检测凋亡细胞 实验目的 了解凋亡细胞的变化及检测方法。 了解 FITC-AnnexinV/PI 双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。 实验原理 细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀 (cell suicide )。膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。在细胞凋亡 早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与 AnnexinV 结合，使其被染成绿 色。在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得 PI 进入细胞当中与 DNA结合， 使其被染成红色。 细胞坏死( cell necrosis )：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而 造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀( cell murder )。 喜树碱( camp tothecin ， CPT)是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱 导肿瘤细胞凋亡。 Annexin V 是一种可与磷脂酰丝氨酸( phosphatidylserine ，PS)特异 结合但不能通过正常细胞膜的物质。 碘化丙啶(propidium iodide ，PI ) 是一种发出红色荧光的 DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。 细胞凋亡早期，细胞膜 PS 由膜脂双层内侧转位至外侧， FITC 标记的 AnnexinV(AnnexinV-FITC )即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。细胞凋 亡中晚期，膜通透性变大， PI 可进入细胞与核内 DNA结合。 激光共聚焦显微镜( LSCM)以单色激光作为光源，并用附设光源针孔 (pinhole) 使光源成为点光源 . 除此之外，在检测器前方也有一个检测针 孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上 的被照射点在检测针孔成像， 由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受， 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置 相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测 针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦” ， 这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模 糊的缺点。多通道 LSCM还可同屏采集显示 3 个不同发射波长的荧光色及 1 个混合色图像， 对研究 2 种或 2 种以上物质的共存有明显优点。 在显 微镜的载物台上加一个微量步进马达控制载物台的升降，最小步进距离 为 0.1 μ m，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本的 各个光学横断面的图像，实现“光学切片”的目的。通过不同的焦平面 产生的光学切片， 可得到一块较厚标本的三维图像， 这是 LSCM最重要的 作用之一。将存储在计算机中的光学切片的焦平面信息结合起来，即可 描述该标本的三维图像。目前 LSCM最大有效解析厚度为 0.45mm，扫描 最小距离为 0.1 μm。 流式细胞分选仪的作用原理： 当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样 品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推 动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷 口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均 匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不 同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下 偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器， 从而实现细胞的分离。流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高 能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其 产生的散射光和发射荧光的强度， 从而对细胞 （或微粒）的物理、生理、 生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测 的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗 粒亚群分开并可实现单克隆分选， 能复杂样本中的细胞进行鉴定、 分类、 定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯 化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。 分选后的细胞能直接用于培养、 移植、核酸提取、单细胞 PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基 因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本 细胞丢弃的比例低于 5%，保证样本中目标细胞的高回收率。 三、 实验仪器及试剂 a） 材料：提前 7 天接瘤，并在实验前 24~48h 腹腔注射用生理盐水配制的 羟基喜树碱溶液诱导凋亡。 b） 试剂： 1mg/mL羟基喜树碱溶液。 0.01mol/L PBS （pH7.4）。 AnnexinV- FITC 凋亡检测试剂盒。 2mg/mL的 PI 贮存液：用 pH7.4 的 PBS配制， -20 ℃保存（ 3 个月）。 用时在 PBS中稀释 1500