免疫学检验技术、教学服务模块 免疫细胞的分离、课件 免疫细胞的分离.pptx

免疫细胞的分离 免疫学检验技术 职业教育医学检验技术专业教学资源库 — * — 提问 免疫细胞的分离 一位HIV感染患者，现要全面评价其免疫功能，需要进行T细胞计数，怎样 分离纯化T细胞呢？ — * — 免疫细胞的分离 标本 血液 离心后的抗凝血 血液成分组成及比密 ①血浆（1.030-1.035） ②血小板PLT（1.030-1.035） 白细胞WBC（单核细胞M+淋巴细胞L：1.075-1.090；粒细胞N+E+B：1.092） ③红细胞RBC（1.093） 外周血单个核细胞（PBMC）：L+M — * — 免疫细胞的分离 PBMC的分离（比密不同） 1、Ficoll分离法 1）分层液：聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque，均为商品名）分层液（1.077±0.001） 2）方法：单次密度梯度离心分离法（离心一次） — * — 免疫细胞的分离 PBMC的分离（比密不同） 1、Ficoll分离法 3）过程：取外周血，置于肝素抗凝管中→PBS液稀释→沿管壁轻轻叠加在Ficoll-Hypaque分层液上→离心、观察→沿管壁轻轻吸取单个核细胞→洗涤、离心、计数→台盼蓝染色（活细胞不着色、死细胞呈蓝色） 4）结果：细胞获得率80%（T＞25℃有影响），纯度95%，其中淋巴细胞占60%~70%。 动画：Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞的基本过程 — * — 免疫细胞的分离 PBMC的分离（比密不同） 2、Percoll分层液法 1）分层液：Percoll【经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理的大小不一的硅胶颗粒】（大小不一、重量不一） 2）方法：连续密度梯度离心分离法（离心两次） — * — 免疫细胞的分离 PBMC的分离（比密不同） 2、Percoll分层液法 3）过程： 第一次离心：PVP处理的硅胶颗粒形成从下到上依次递减的连续密度梯度；将抗凝全血稀释液加在离心后的硅胶颗粒上； 第二次离心：血液中的每一种细胞根据自己的重量，在连续的密度梯度中找到自己的位置，形成上图中的细胞带。 动画：Percoll分层液法分离血细胞的基本过程 — * — 免疫细胞的分离 淋巴细胞的纯化 PBMC 去除成分 ①红细胞RBC ②血小板PLT ③单核细胞M — * — 设计情景提问 免疫细胞的分离 准备三个烧杯，分别加入低渗盐水（0.85%NaCl）、等渗盐水（=0.85%NaCl） 和高渗盐水（0.85%NaCl），将正常人的红细胞放进去，它的形态会发生怎样的 变化呢？哪一种液体适合破坏红细胞？ 动画：红细胞在低渗、等渗和高渗NaCl溶液中的形态变化 — * — 免疫细胞的分离 1）低渗裂解法（无菌蒸馏水适量） 2）氯化铵裂解法 去除红细胞 1）少量血小板→洗涤 2）很多血小板→胎牛血清梯度离心 去除血小板 — * — 免疫细胞的分离 去除单核细胞 1）黏附法（M黏附玻璃、塑料、棉花纤维和葡聚糖凝胶，37℃，Ca2+） （黏附去除） — * — 免疫细胞的分离 去除单核细胞 2）羧基铁吞噬法（M具有吞噬功能）（磁铁吸附去除） 动画：羧基铁吞噬法去除PBMC中的单核细胞 — * — 免疫细胞的分离 去除单核细胞 2）苯丙氨酸甲酯去除法 （M含溶酶体） 动画：苯丙氨酸甲酯法去除PBMC中的单核细胞 — * — 免疫细胞的分离 淋巴细胞亚群的分离（主要分离T、B细胞） 待分离T细胞/B细胞 分离方法 1、E花环沉降法 2、尼龙棉分离法 3、免疫磁珠分离法 4、流式细胞术分离法（最好） — * — 免疫细胞的分离 E花环沉降法（主要分离T细胞） 机理：成熟T细胞表面有SRBC受体（CD2/E受体），能与SRBC结合，形成玫瑰花环样细胞团（E花环）。 动画：E花环沉降法分离T细胞的过程 — * — 免疫细胞的分离 E花环沉降法（主要分离T细胞） 过程： 1）SRBC和PBMC混合，SRBC和T细胞充分反应，形成E花环； 2）用Ficoll分层液分离E花环； 3）低渗法裂解SRBC，可得到T细胞。 结果：纯度为95%~99%，T细胞可刺激活化。 — * — 免疫细胞的分离 尼龙棉分离法（主要分离B细胞） 机理：B细胞易黏附尼龙棉纤维，T细胞不易黏附。 过程： 1）尼龙棉均匀地填充在内径5-6nm的聚乙烯塑料管内，制成尼龙棉柱； 2）经Hank’s液，浸泡平衡； 动画：尼龙棉分离法分离T、B细胞 — * — 免疫细胞的分离 尼龙棉分离法（主要分离B细胞） 3）将待分离的细胞悬液加入柱中，37℃，静置1-2h； 4）用预热的含10%-20%小牛血清细胞培养液洗