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免疫细胞的分离
免疫学检验技术
职业教育医学检验技术专业教学资源库
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提问
免疫细胞的分离
一位HIV感染患者,现要全面评价其免疫功能,需要进行T细胞计数,怎样
分离纯化T细胞呢?
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免疫细胞的分离
标本 血液
离心后的抗凝血
血液成分组成及比密
①血浆(1.030-1.035)
②血小板PLT(1.030-1.035)
白细胞WBC(单核细胞M+淋巴细胞L:1.075-1.090;粒细胞N+E+B:1.092)
③红细胞RBC(1.093)
外周血单个核细胞(PBMC):L+M
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免疫细胞的分离
PBMC的分离(比密不同)
1、Ficoll分离法
1)分层液:聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque,均为商品名)分层液(1.077±0.001)
2)方法:单次密度梯度离心分离法(离心一次)
— * —
免疫细胞的分离
PBMC的分离(比密不同)
1、Ficoll分离法
3)过程:取外周血,置于肝素抗凝管中→PBS液稀释→沿管壁轻轻叠加在Ficoll-Hypaque分层液上→离心、观察→沿管壁轻轻吸取单个核细胞→洗涤、离心、计数→台盼蓝染色(活细胞不着色、死细胞呈蓝色)
4)结果:细胞获得率80%(T>25℃有影响),纯度95%,其中淋巴细胞占60%~70%。
动画:Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞的基本过程
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免疫细胞的分离
PBMC的分离(比密不同)
2、Percoll分层液法
1)分层液:Percoll【经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的大小不一的硅胶颗粒】(大小不一、重量不一)
2)方法:连续密度梯度离心分离法(离心两次)
— * —
免疫细胞的分离
PBMC的分离(比密不同)
2、Percoll分层液法
3)过程:
第一次离心:PVP处理的硅胶颗粒形成从下到上依次递减的连续密度梯度;将抗凝全血稀释液加在离心后的硅胶颗粒上;
第二次离心:血液中的每一种细胞根据自己的重量,在连续的密度梯度中找到自己的位置,形成上图中的细胞带。
动画:Percoll分层液法分离血细胞的基本过程
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免疫细胞的分离
淋巴细胞的纯化
PBMC
去除成分
①红细胞RBC
②血小板PLT
③单核细胞M
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设计情景提问
免疫细胞的分离
准备三个烧杯,分别加入低渗盐水(0.85%NaCl)、等渗盐水(=0.85%NaCl)
和高渗盐水(0.85%NaCl),将正常人的红细胞放进去,它的形态会发生怎样的
变化呢?哪一种液体适合破坏红细胞?
动画:红细胞在低渗、等渗和高渗NaCl溶液中的形态变化
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免疫细胞的分离
1)低渗裂解法(无菌蒸馏水适量)
2)氯化铵裂解法
去除红细胞
1)少量血小板→洗涤
2)很多血小板→胎牛血清梯度离心
去除血小板
— * —
免疫细胞的分离
去除单核细胞
1)黏附法(M黏附玻璃、塑料、棉花纤维和葡聚糖凝胶,37℃,Ca2+)
(黏附去除)
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免疫细胞的分离
去除单核细胞
2)羧基铁吞噬法(M具有吞噬功能)(磁铁吸附去除)
动画:羧基铁吞噬法去除PBMC中的单核细胞
— * —
免疫细胞的分离
去除单核细胞
2)苯丙氨酸甲酯去除法
(M含溶酶体)
动画:苯丙氨酸甲酯法去除PBMC中的单核细胞
— * —
免疫细胞的分离
淋巴细胞亚群的分离(主要分离T、B细胞)
待分离T细胞/B细胞
分离方法
1、E花环沉降法
2、尼龙棉分离法
3、免疫磁珠分离法
4、流式细胞术分离法(最好)
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免疫细胞的分离
E花环沉降法(主要分离T细胞)
机理:成熟T细胞表面有SRBC受体(CD2/E受体),能与SRBC结合,形成玫瑰花环样细胞团(E花环)。
动画:E花环沉降法分离T细胞的过程
— * —
免疫细胞的分离
E花环沉降法(主要分离T细胞)
过程:
1)SRBC和PBMC混合,SRBC和T细胞充分反应,形成E花环;
2)用Ficoll分层液分离E花环;
3)低渗法裂解SRBC,可得到T细胞。
结果:纯度为95%~99%,T细胞可刺激活化。
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免疫细胞的分离
尼龙棉分离法(主要分离B细胞)
机理:B细胞易黏附尼龙棉纤维,T细胞不易黏附。
过程:
1)尼龙棉均匀地填充在内径5-6nm的聚乙烯塑料管内,制成尼龙棉柱;
2)经Hank’s液,浸泡平衡;
动画:尼龙棉分离法分离T、B细胞
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免疫细胞的分离
尼龙棉分离法(主要分离B细胞)
3)将待分离的细胞悬液加入柱中,37℃,静置1-2h;
4)用预热的含10%-20%小牛血清细胞培养液洗
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