分子基本操作技术.pptVIP

从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速 发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作 和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分 子生物学研究的核心技术。  基因组DNA提取技术 凝胶电泳技术  第一节凝胶电泳技术 一、常规电泳 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 二、脉冲凝胶电泳  ·自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小 分离DNA的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重纽DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,也是现在通用的许 多分子生物学研究方法,如:DNA分型、DNA核苷酸序列分析、 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础,受到科学 界的高度重视。 基本原理:生物大分子在一定pH条件下,通常会带电荷。将其放 置到电场中,就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用 下的迁移速度,与电场强度和电泳分子所槜带的净电荷数成正比, 与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度 电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分。’可通过 的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数  在生理条件下,核酸分子之糖_磷酸骨架中的磷酸基国,是呈离子 化状态的,所以,DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子 polyanions),把这些核酸分子放置在电场当中,它们就会向正 电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度 向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移 速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型。这 就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 5  1、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的 分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 ·根据琼溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和 低熔点琼脂糖 ·低熔点琼脂糖熔点为62~65℃,溶解后在37℃ 下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段 的回收,质粒与外源性DNΔ的快速连接等  1)凝胶浓度选择 琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围 凝胶的分辨能力琼脂糖浓线型DNA分子的分 同凝胶的类型和浓 度(%) 离范围(Kb) 度有关,凝胶浓度 0.3 5~60 的高低影响凝胶介 质孔隙的大小,浓 0.6 ~20 度越高,孔隙越小 0.7 0.8~10 ,其分辨能力就越 0.9 0.5~7 强。反之,浓度降 09~6 低,孔隙就增大, 1.5 其分辨能力也就随 0.2~3 之减弱。 12.0 0.1~2  2)电咏缓冲液 ·常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE) Ttis-乙酸(TAE) Tris-磷酸(TPE) TB与TPE:缓冲容量高,DNA分离效果 好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓 度高,容易使DNA沉淀 TAE:缓冲容量低,但价格较便宜。缓冲 液中的EDTA可螯合二价阳离子,从而抑 制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解  4)栽枰缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成载样缓冲液 作用: ①增加样品密度,使其比重增加,以 确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带, 可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色,使加样操作更方便  在紫外线的照射下结合溴化乙锭的 DNA分子发出荧光 在凝胶电泳中,加入适 量澳化乙锭( ethidium 123 bromide,简称EBr)染 料对核酸分子进行染色 ,然后将电泳标本放置 在紫外光下观察,可十 分灵敏而快捷地检测出一==m 凝胶介质中DNA的谱带 部位,即使每条DNA带2 中仅含有0.054g的微量 DNA,也可以被清晰地 检测出来。