CsSULTR1;1和CsSULTP1;2在茶树硒吸收过程中的功能研究.pdfVIP

摘 要 硒是人体所必需的营养元素，硒酸盐是土壤中可被植物利用硒元素的主要存在形态，研究表 明植物主要通过硫酸盐转运蛋白来吸收硒酸盐。其中属于第一亚家族的 SULTR1;1 和 SULTR1;2 被认为是参与植物硒吸收的主效基因。课题组前期克隆到茶树硫酸盐转运蛋白基因家族的8 条基 因，初步研究发现CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 可能在茶树硒吸收转运过程中承担重要作用。为 了进一步明确茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 在硒吸收过程中的功能，本 论文采用基因克隆、生物信息分析、亚细胞定位、转基因拟南芥和 qRT-PCR 等实验技术研究了 两个基因启动子的调控机制以及CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 对硒、硫（Se、S）处理的响应机制， 为后续开展茶树硒营养调控提供理论依据。本文的主要结果如下： 1. 明确了CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 对Se 和S 的响应。在缺S 加Se6+ 的处理下CsSULTR1;1 和 CsSULTR1;2 都出现了显著的上调表达，但加S 加 Se6+ 的处理下，CsSULTR1;1 并未出现特殊 响应，这表明CsSULTR1;1 的上调可能是受到缺S 诱导。加S 加Se6+可明显诱导CsSULTR1;2 的 表达，结合缺S 条件下的表达分析可以发现，不论S 是否存在，CsSULTR1;2 对较高浓度Se6+都 有特异性响应。在正常S 供应添加不同浓度的 Se4+处理，CsSULTR1;1 在每个时间点均出现显著 的下调，说明Se4+显著抑制了CsSULTR1;1 的表达。CsSULTR1;2 在0.6 mg/kg Se4+和3mg/kg Se4+ 处理下都在第3 天出现显著上调，随后恢复到正常水平。这表明CsSULTR1;2 可能对Se4+也有特 异性响应。综合来看，不论是否有S 存在，不论 Se6+还是 Se4+处理，CsSULTR1;2 能明显响应硒 处理的刺激，可能在茶树硒吸收过程中起主要作用。 2. 研究了CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 的启动子对Se、S 的响应情况。克隆到长度约2000 bp 的启动子片段，其含有多种与植物生长发育相关的激素响应元件和环境胁迫响应元件。不同组织 的 GUS 染色结果显示，CsSULTR1;1 的启动子主要在转基因拟南芥的根系和子叶叶尖被激活， CsSULTR1;2 的启动子在根、茎、叶柄和叶脉等维管束组织以及花的柱头和荚果等都有激活。不 同Se、S 处理下的GUS 染色结果显示缺S 会显著诱导CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 启动子的转录 活性。硒酸盐在有S 或缺S 情况下均能显著诱导两个目的基因启动子的转录活性。 3. 成功克隆到CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 的CDS （Coding sequence ）全长序列，并对其功 能进行了深入解析。不同时期的茶树组织表达特异性结果显示，CsSULTR1;1 在根中高表达，而 CsSULTR1;2 在茎中高表达。春季茶树生长期 CsSULTR1;1 和 CsSULTR1;2 表达量要高于冬季休 眠期。CsSULTR1;1 在生长期的表达量呈现出成熟叶高于根，而在休眠期则刚好相反。CsSULTR1;2 不论在生长期还是休眠期茎中的表达量都要远高于根。在烟草叶肉细胞和水稻原生质体的亚细胞 定位显示，CsSULTR1;1 和CsSULTR1;2 都定位于细胞膜和细胞质中。CsSULTR1;1 的过表达株系 在0 μmol Se6+ 、0.5 μmol Se6+ 、5 μmol Se6+和50 μmol Se6+ 的培养基中培养7 天后，两个过表达株 6+ 系根长均要长于野生型，且达到显著或极显著水平，但100μmol Se 处理下过表达株系与野生型 株系的根长并无差异。CsSULTR1;2 的一个过表达株系与CsSULTR1;1 的结果一致。而CsSULTR1;2 另一个株系在不同浓度硒酸盐处理下根长均显著长于野生型。 关键词：茶树，硫转运蛋白，硒，启动子分析，基因功能验证 I