LAP1_2缺失PRV潜伏转录物相关分子表达特征的研究.pdfVIP

摘 要 伪狂犬病 （Pseudorabies）是由伪狂犬病病毒引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒 （猪 除外）、脑脊髓炎、呼吸系统和神经系统障碍为主要症状的一种急性传染病。猪是PRV 的天然 宿主，也是本病的长期贮存宿主和排毒者。伪狂犬病病毒可以在感染后存活下来的猪中建立潜 伏感染。由于受到外界环境变化或者身体受到应激，处于潜伏感染状态的伪狂犬病病毒可以被 激活并且释放至环境中，从而感染其他动物，导致伪狂犬病病毒长期存在猪群中，难以根除。 PRV在潜伏感染时病毒基因组不复制，也不表达病毒蛋白，仅大量转录病毒潜在相关转录 物 （Latency-associated transcript，LATs）。目前有关LATs基因在PRV 潜伏感染期是如何进行 表达的尚不清楚，但是根据已有的报道涉及到两个启动子LAP1和LAP2。因此本研究利用伪狂 犬病病毒BAC 克隆和 galk 负筛选技术成功构建了一批有关两个启动子缺失的病毒：包括 LAP1/2均缺失的突变病毒JS-US和JS-RS；LAP1/2缺失并加入转录终止序列BGH 的突变病毒 JS-UBS；LAP1/2 缺失并添加绝缘子cHS4 和转录终止序列BGH 的突变病毒JS-U1CBS和JS- U2CBS。将突变病毒与亲本病毒JS-2012 的体外生物学特性比较，结果显示：突变病毒JS-US、 JS-RS和JS-U1CBS无论是在空斑大小和形态还是在复制动力学特征上与亲本病毒相比都是差异 不显著，但是突变病毒JS-UBS和JS-U2CBS 的复制速度比亲本病毒慢很多。 随后，我们成功构建了针对LLT分子转录的简便快速的RT-qPCR检测方法，该方法可以避 免病毒基因组的存在对基因转录检测的影响。并且利用构建的RT-qPCR 方法对LLT 和EP0 的 表达特征进行了研究。结果表明，LLT和EP0在感染2h 时就可以被转录，8h 时表达量最高，之 后逐渐减少，并且在神经细胞和非神经细胞中表达情况差异极显著。在非神经细胞和神经细胞 中，突变病毒感染细胞后LLT分子的表达量与亲本病毒相比均降低。但是，病毒在神经细胞中 的表达量高于非神经细胞，Vero细胞中的表达量高于PK-15细胞。第二个启动子LAP2可以影 响LLT 的表达，缺失后导致LLT 的表达量降低。LAT 启动子前重复序列影响LLT在神经细胞 中的表达，缺失后也会导致LLT 的表达量大大降低。 TK基因是PRV 的主要毒力基因，TK基因缺失会导致PRV毒力的大大降低，并且TK基因 缺失病毒不能引起小鼠的死亡。为了建立PRV潜伏感染动物模型，本文将PRV TK基因缺失株 接种大鼠。然而，TK基因缺失株分别通过滴鼻和肌肉注射两种方式接种大鼠，大鼠均会出现死 亡。发现采取这两种方式攻毒在神经组织中的病毒含量最高，而且组织中的病毒载量与接毒剂 量成正比；并且JS2012-△TK攻毒的组织中的病毒载量与亲本病毒相比大幅度降低。这表明， TK基因缺失能降低PRV对大鼠的致病力，但TK基因缺失PRV仍对大鼠具有致死能力。 关键词：伪狂犬病病毒，LAP1/2，LLT，TK基因 I Abstract Pseudorabies is an acute infectious disease caused by pseudorabies virus in a variety of domestic animals and wild animals with fever,itching(except pigs),encephalomyelitis,respiratory and nervous system disorders as the main symptoms.Pigs are the natural hosts of PRV，as well as the long-term storage host and detoxification of this disease.Pseudorabies can establish latent infection in pigs that survive infection.Due to changes in the external environment or stress on the body,the pseudorabies virus