PDCoV感染猪肠类器官模型的建立及肠道组织嗜性的分子机制研究.pdfVIP

摘 要 猪德尔塔冠状病毒 （Porcine deltacoronavirus ，PDCoV ）是近年新发现的一种猪肠致病性冠状 病毒，感染主要造成新生仔猪的急性腹泻，严重危害全球养猪业的发展。PDCoV 体内感染的主 要部位是猪小肠，体外能感染包括人，猪和鸡等多种物种来源的细胞，具有潜在的跨种间传播能 力，阐明决定其细胞和肠道组织嗜性的分子机制显得尤为重要。然而，由于缺乏能模拟体内肠上 皮高度复杂的结构和功能的体外研究模型，PDCoV 感染与宿主肠上皮相互作用的研究受到了限 制。最近，一种在体外建立的肠类器官模型能概括体内肠上皮复杂的生理特性，为阐明 PDCoV 的致病机制提供了一个理想的体外研究模型。 首先，为探究PDCoV 能否感染猪肠类器官，本研究在体外分离培养了隐窝干细胞来源的猪 肠类器官。分别利用实时荧光定量 PCR （qPCR ），TCID50 和间接免疫荧光 （IFA ）分析 PDCoV 在猪肠类器官中的感染情况，结果显示猪肠类器官对PDCoV 易感，能够支持子代病毒粒子的释 5.33 放 （病毒效价可达 10 TCID50/mL ）。为探索PDCoV 感染肠上皮的靶细胞类型，通过IFA 检测 表明PDCoV 能感染肠细胞，干细胞以及杯状细胞等多种功能性的肠道上皮细胞。其次，为探究 猪肠类器官能否模拟PDCoV 体内感染的肠道组织嗜性，分别通过qPCR ，TCID50 和IFA 分析发 现，PDCoV 在空肠类器官中的复制水平明显高于十二指肠类器官和结肠类器官，与PDCoV 体内 感染结果相符。为进一步探究 PDCoV 肠道组织嗜性的分子机制，通过转录组测序 （RNA-Seq ） 及qPCR 分析发现不同肠段来源的肠类器官的转录谱呈肠段特异性的表达模式，PDCoV 的肠道组 织嗜性与细胞受体猪氨基肽酶 N （pAPN ）在不同肠段中的差异表达密切相关，而与冠状病毒感 染相关的宿主蛋白酶和干扰素（IFN ）受体的表达水平无明显关联。为进一步探究IFN 免疫应答 是否与PDCoV 的肠道组织嗜性相关，我们研究发现PDCoV 在空肠类器官中诱导抗病毒因子的表 达水平显著高于十二指肠类器官和结肠类器官，与PDCoV 在肠类器官中的复制水平一致，表明 IFN 免疫应答与PDCoV 的肠道组织嗜性不相关。此外，我们监测了PDCoV 感染肠类器官后IFN 的表达，结果显示在PDCoV 感染晚期显著诱导Ⅰ型和Ⅲ型IFNs 产生，而通过外源IFN-λ 1 处理能 显著抑制PDCoV 在肠类器官中的复制，这进一步排除了IFN 免疫应答与PDCoV 的肠道组织嗜 性无关是由于病毒对IFN 耐受导致的。 综上所述，本研究揭示了PDCoV 肠道组织嗜性的分子机制，为阐明PDCoV 的致病机制提供 了新的见解。同时，本研究结果表明猪肠类器官可作为研究猪肠道冠状病毒致病机制的良好体外 研究模型，这为深入探究肠道病毒的分子生物学特性奠定了基础。 关键词：猪德尔塔冠状病毒，肠类器官，猪氨基肽酶N ，干扰素，干扰素受体 I Abstract Porcine deltacoronavirus (PDCoV), a recently discovered porcine enteropathogenic coronavirus, mainly causes acute diarrhea in newborn piglets, which has posed a serious threat to the global pork industry. The main site of PDCoV infection in vivo is porcine small intestine, which can infect cells from broad species including human, porcine and chicken in vitro, and has a potential capacity of