MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用.pdfVIP

摘 要 为了解决多种鸭病病毒没有适合的传代细胞系的现实问题，本论文利用无特定病原体 （Specificpathogen free, SPF）鸭开展了鸭胚肝间充质干细胞（Duck embryo liver mesenchymal stem cells,DuLMSC）的研究。 抗原相关转运体 （Transporter associatedwith antigen processing,TAP）基因 （Tap1和Tap2） 和主要组织相容性复合体（Majorhistocompatibility complex,MHC）I 类分子重链编码基因（UAA） 位于鸭MHC 的核心区域，且位置比邻。本研究测定了Tap1和Tap2 序列纯合的4 个鸭品系 （B1、 B2、B3 和B4）的UAA 编码区序列，确定了各品系内UAA 序列同源。利用此4 个品系，采用Ⅳ 型胶原酶消化法从鸭胚肝脏中分离DuLMSC，体外可传代培养至50代。细胞形态稳定呈长梭形 贴壁生长，不表达造血干细胞分子标记，能够向成骨细胞和成脂细胞分化，且前35代细胞对裸 鼠无致瘤性。将4 个细胞株，分别命名为DuLMSC/1、DuLMSC/2、DuLMSC/3 和DuLMSC/4。 为比较鸭肠炎病毒 （Duck enteritis virus, DEV）对4 个细胞株的适应性，我们将DEV C-K CE 株分别接种到4 个细胞株上并连续传 10代。结果显示F1至F10代病毒接种细胞后，均产生 典型的细胞病变 （Cytopathic effect, CPE）；F1至F10代病毒均能特异性地扩增出DEV 的UL2 基因片段，且F1、F5和F10代病毒的UL2 基因核苷酸序列与原种毒完全同源；接毒24 h 的细 胞的细胞浆、细胞核和细胞间隙内存在典型的疱疹病毒样粒子；DEV 在4 个细胞株上的一步生长 曲线表明DuLMSC/4 上的各个时间点对应的病毒滴度都高于或接近其他3个细胞株；另外，F1 至F10代的病毒滴度从F5代开始趋于稳定，DuLMSC/3 或DuLMSC/4 上的病毒滴度比DuLMSC /1或DuLMSC/2 高约0.5个TCID ，且在4 个细胞株上前五代的病毒滴度平均值始终比在CEF 50 细胞上高0.5个TCID 左右。 50 在分析鸭甲型肝炎病毒 （Duck hepatitis A virus, DHAV）1型弱毒株和DHAV-3 弱毒株对D uLMSC/4 的适应性时，DHAV-1连续传代至F8代时产生CPE，F1至F15代病毒均能特异性地扩 增出DHAV-1 的3D 基因片段且F1、F7 和F15代的3D 基因核苷酸序列与原种毒完全同源；DHA V-3连续传代至F3代时产生CPE，F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-3 的VP1基因片 段且F1、F7 和F15代的VP1基因核苷酸序列与原种毒完全同源。病毒增殖曲线结果显示DHAV- 1核酸相对拷贝数范围为1-30，而DHAV-3 核酸相对拷贝数在 10-120 之间。 利用B3系鸭UAA部分α2和完整α3 区的大肠杆菌表达产物制备了鸭MHCI类分子特异性鼠 源单抗G1。G1 的重链为IgM，轻链为Kappa 型。G1对B4 鸭外周血细胞和对SPF 白来航鸡外周 血细胞的流式细胞术检测结果分别为70.3%和19.4%。DEV 感染DuLMSC/4 后，细胞表面MHCI 类分子的表达量先下调后上调，而细胞内MHC I类分子转录水平始终上调，推测DEV 感染早期 能抑制MHCI 的递呈。 本研究建立的DuLMSC/4，能支持DEV 和DHAV 增殖，能用于MHC I 相关的基础研究，是 鸭病防控技术研发的良好实验材料。 关键词：主要组织相容性复合体，单倍型，鸭胚肝间充质干细胞，鸭肠炎病毒，鸭甲型肝炎病毒 I Abstract In order to solve the practical problem that a variety of duck disease viruses do not have suitable passage cell lines, this paper used ducks with specific patho