Nrf2单抗制备及在EIAV感染与Nrf2抗氧化通路调控研究中的应用.pdfVIP

摘 要 Nrf2-ARE （转录因子NF-E2 相关因子2 ）是抗氧化防御体系的第一道防线，是细胞对抗病毒 感染所引起氧化应激最重要的防御系统。Nrf2 抗氧化通路不仅是天然免疫和病毒调控研究领域的 热点，也是氧化应激相关疾病（病毒性疾病、癌症、心血管系统疾病和炎症等疾病）预防和治疗 的靶点。 马传染性贫血病毒（EIAV ）与人免疫缺陷病毒（HIV-1）、猴免疫缺陷病毒（SIV ）等均隶 属于逆转录病毒科慢病毒属。该属病毒感染临床上皆以反复发热、持续感染、炎性反应强烈且难 产生有效免疫保护为共同特征。因此，宿主如何克服病毒的持续性感染、调控炎症平衡、产生有 效的免疫控制仍是该领域亟待解决的科学问题。EIAV 在慢病毒研究领域的重要意义正在于此。 90% EIAV 感染马会转归为无症状的携带状态，说明宿主获得了对病毒复制的免疫控制。这一独 特性使EIAV 成为研究如何实现天然免疫控制慢病毒感染的重要模型。我们通过对EIAV 感染后 的转录组数据分析发现，重要的天然免疫通路—Nrf2 抗氧化通路的相关基因上调明显。因此，本 研究从抗氧化应激与病毒感染这一角度，探讨了Nrf2-ARE 抗氧化通路对EIAV 感染调控的分子 机制。 为了保障实验的开展，本研究首先利用经典的单克隆技术制备并获得了马源的 Nrf2 单克隆 抗体，获得的单克隆抗体可有效识别过表达及内源性Nrf2 的表达，具有较高的敏感性和特异性， 可用于后续机制的研究。在此基础上，利用Nrf2-ARE-luc 报告系统，结合Nrf2 的磷酸化水平及 细胞质和细胞核内的分布情况等方面的综合检测，筛选并确认了 EIAV Rev 可以有效激活 Nrf2-ARE 抗氧化通路。Co-IP 结果显示，Rev 可以和Nrf2 的负调控因子Keap1 结合，且Rev 和 Keap1 结合的结构域与Nrf2 和Keap1 结合的结构域非常相似。该结果提示，三个蛋白间可能存 在竞争性结合。为此，分别构建了3 个蛋白的表达载体，经表达、纯化及生物素标记后，进行了 Rev-Keap1 和Nrf2-Keap1 亲和力检测及竞争性试验。结果显示，Rev-Keap1 与Nrf2-Keap1 这 3 个蛋白间存在竞争性结合关系。并且，这种竞争性结合促进了Nrf2 的入核。另外发现，干扰Nrf2 的内源性表达后，EIAV 的复制水平上调，而过表达Nrf2 可以显著抑制EIAV 的复制。说明Nrf2 激活后可以抑制EIAV 复制。 综上所述，本研究成功制备了马源Nrf2 单克隆抗体，明确了EIAV Rev 通过与Keap1 的结合 竞争性抑制了Keap1-Nrf2 的结合，使Keap1 对Nrf2 的绑定能力减弱，导致Nrf2 进入细胞核，与 其下游作用原件ARE 结合。从而激活Nrf2 这一重要的抗氧化通路的分子机制。本研究所获的结 果，不仅明确了EIAV 激活Nrf2 抗氧化通路的分子细节，也为进一步探讨宿主对EIAV 的天然免 疫调控奠定了重要基础。 关键词：EIAV ，Nrf2 ，Nrf2-ARE抗氧化系统，Rev ，Keap 1 I Abstract As the master regulator of cellular defence mechanism against oxidative stress, Nrf2-ARE (transcription factor NF-E2-related factor 2) plays a crucial role in the cytoprotection against the cumulative damaging effects of oxidative stress induced by virus infection. Importantly, cross-talking with other innate immune signals hightlights the role of Nrf2 path