PEDV毒株的分离鉴定及抗体ELISA检测方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea ，PED ）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV ）引起的一种急性、高致病性肠道传染病，主要危害哺乳仔猪。临床表 现为水样腹泻，呕吐脱水等症状。哺乳仔猪通过乳汁中的母源抗体（分泌性 IgA ）获得被动 免疫保护是较为有效的预防方式，检测乳汁中的抗体对于防控PED 具有重要意义。 本研究从临床检测病料中分离到一株 PEDV 并进行鉴定；在HEK-293 悬浮细胞中表达 了该毒株的N 蛋白，以其为抗原分别建立了检测 PEDV 血清 IgG 及乳汁 IgA 抗体的间接 ELISA 检测方法，为PEDV 的预防提供支持。相关研究结果如下： 1. PEDV-JX18 毒株的分离与鉴定 2018 年江西省某猪场送检疑似感染PEDV 的小肠组织，剪碎研磨并用细胞培养基过夜浸 泡研磨组织获得病毒液，通过Vero 细胞进行病毒分离，在Vero 细胞上盲传至第五代时观察 到细胞病变，经RT-PCR ，IFA ，透射电镜及细胞超薄切片等方法鉴定，确定分离出一株田间 的猪流行性腹泻病毒，并命名为PEDV-JX18 株。 2. PEDV 血清IgG 间接ELISA 方法的建立 将PEDV-JX18 株N 基因克隆到pcDNA3.4 （+ ）质粒上，瞬时转染悬浮培养的HEK-293 细胞并纯化获得N 蛋白，作为研制PEDV 血清IgG 抗体的间接ELISA 方法的包被抗原。优 化各组分的剂量及孵育时间确定最佳反应条件，抗原包被量为 2 g/mL，最佳血清稀释度为 1：80，孵育时间为37 ℃ 30 min ，山羊抗猪IgG-HRP 稀释浓度为1：4000 ，孵育时间为37 ℃， 1.5 h ，TMB 显色时间为37 ℃，15 min 。使用40 份PEDV 阳性血清及178 份阴性血清样品 对间接ELISA 方法进行评价，运用SPSS 17.0 软件绘制ROC 曲线对结果判定，确定临界值 为0.585 ，敏感性为100 %，特异性为96.7 % 。重复性试验结果表明其变异系数均小于10 %， 说明建立的用于检测PEDV 血清IgG 的间接ELISA 方法具有良好的稳定性及可重复性。 3. PEDV 乳汁 IgA 间接ELISA 方法的建立 以HEK-293 细胞表达的重组PEDV N 蛋白作为包被抗原，建立检测PEDV 乳汁中IgA 抗体的间接ELISA 方法。优化各组分的剂量及孵育时间确定最佳反应条件，最佳抗原包被量 为1 g/mL，最佳乳汁稀释倍数为1：2 ，乳汁孵育时间为37 ℃，30 min ，山羊抗猪 IgA-HRP 稀释浓度为1：2000 ，孵育时间为37 ℃，1 h ，TMB 显色时间为37 ℃，10 min 。选取实验室 保存的31 份乳汁阳性样品及25 份阴性乳汁样品运用SPSS 17.0 软件绘制ROC 曲线，确定临 界值为0.653 ，敏感性为100 %，特异性为96 % 。重复性试验结果表明其变异系数均小于10 %， 说明建立的检测PEDV 乳汁IgA 间接ELISA 方法具有良好的稳定性及可重复性。 本研究成功分离到一株PEDV 田间毒株，命名为PEDV-JX18 株；在HEK-293 细胞中成 功表达N 蛋白，并以此作为包被抗原，分别建立检测血清中PEDV IgG 抗体和乳汁中IgA 的 间接ELISA 方法，为PEDV 临床预防提供技术支持。 关键词：PEDV ，病毒分离，IgG ，分泌性IgA ，间接ELISA I Abstract Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly pathogenic intestinal infectious disease caused by Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), which mainly harms suckling piglets. The clinical manifestations are watery diarrhea, vomi