Sec62_Sec63复合物对流行性乙型脑炎病毒复制影响的研究.pdfVIP

摘 要 流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE ）是由流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV ）引起的一种蚊媒性人兽共患病。JEV 可感染人与多种动物，主要的传播媒介为三带喙 库蚊，通过蚊虫的叮咬在宿主之间传播，水鸟和猪为主要的扩大宿主，人为终末宿主。目前流行 性乙型脑炎仍没有有效的治疗方法，以预防为主，主要是通过接种疫苗进行预防。虽然流行性乙 型脑炎目前已得到有效的控制，但对于流行性乙型脑炎病毒的复制周期的研究仍有许多空白，对 于宿主因子在病毒复制周期中的不同阶段发挥的作用仍不清楚。Sec62/Sec63 复合体由 Sec62 蛋 白和Sec63 蛋白组成，为内质网上的跨膜蛋白，主要功能是与参与某些蛋白的新生前体多肽向内 质网的Sec61 通道中的转运过程。Sec62 可以与核糖体相互作用，参与蛋白质的翻译，影响内质 网中蛋白质的易位过程，可以引起内质网应激。Sec63 蛋白由 3 个跨膜结构域组成，内质网内 J 结构域与分子伴侣（Binding Protein, Bip ）相互作用，促进前体蛋白通过Sec61 通道进行易位。为 研究 Sec62/Sec63 复合物对JEV 复制的影响，本研究应用 CRISPR/Cas9 技术分别构建SEC62、 SEC63 基因敲除的HEK-293 细胞系，分别命名为SEC62 KO HEK-293 细胞与SEC63 KO HEK-293 细胞。分别以MOI 为1、0.05 的JEV 感染HEK-293 、SEC62 KO HEK-293 、SEC63 KO HEK-293 细 胞后，利用间接免疫荧光试验检测Sec62/Sec63 复合物对JEV 复制的影响，结果显示不同剂量JEV 感染SEC62 KO HEK-293 细胞与SEC63 KO HEK-293 细胞中荧光信号阳性细胞均少于HEK-293 细胞对照组；以 MOI 为1 的JEV 感染HEK-293 、SEC62 KO HEK-293 、SEC63 KO HEK-293 细 胞后，经western blot 检测结果显示于感染后12h、24h 和48h SEC62 KO HEK-293 、SEC63 KO HEK-293 细胞中均未能检测出JEV E 蛋白条带，而对照HEK-293 细胞中JEV E 蛋白的表达逐渐 增加。分别以MOI 为 1、0.5、0.05 的JEV 感染上述三种细胞后检测细胞培养液中病毒滴度，结 果显示JEV 感染12h 后SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293 细胞与HEK-293 细胞组病毒 滴度无明显差异（p 0.05 ），而在感染后24h 与48h 时，SEC62 KO HEK-293 、SEC63 KO HEK-293 细胞与HEK-293 细胞组病毒滴度差异极显著，SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293 细胞 培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293 细胞对照组（p 0.01 ）。以上结果表明SEC62、SEC63 基 因敲除后均抑制了JEV 的复制，也表明Sec62、Sec63 是影响JEV 在细胞内复制的重要宿主因子。 本研究为进一步探究 Sec62、Sec63 等宿主因子对JEV 复制的影响机制提供了参考依据。 关键词：CRISPR/Cas9，Sec62/Sec63 复合物，流行性乙型脑炎病毒，复制 I Abstract Japanese encephalitis JE is a mosquito-borne zoonosis caused by the Japanese encephalitis virus. JEV is a member of the Flaviviridae Flavivirus family. JEV can infect people and a variety of animals, most of them are recessive infection, human and horse infection will cause neurological symptoms and encephalitis, serious can l