US7_US8_UL23_US3四基因缺失重组伪狂犬病毒的构建及对犬的致病性评价.pdfVIP

摘 要 伪狂犬病（Pseudorabies，PR ）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus ，PRV ）感染引起的一 种烈性传染病，猪被认为是PRV 的自然宿主和主要传染源，免疫接种弱毒疫苗是防控PR 的有效 途径之一。二基因缺失（US7/US8 缺失）和三基因缺失(US7/US8/UL23 ）的PRV 弱毒疫苗广泛应 用于猪伪狂犬病防控，取得了较好的免疫效果。近年来，在我国山东、河北、辽宁和北京等地相 继报道犬、水貂等毛皮动物通过接触接种弱毒疫苗猪的生肉或内脏而导致感染PRV ，表现为搔痒、 发热、呼吸系统障碍和消化系统功能紊乱。犬接种上述弱毒疫苗后发现，弱毒疫苗毒株可在犬群 中水平传播且对犬致病。虽然伪狂犬缺失疫苗对猪是安全的，但免疫接种后，在猪群中未被完全 清除，而犬等毛皮动物通过接触免疫猪的生肉或内脏而感染发病，对犬等毛皮动物仍然具有高致 病性。目前广泛使用的伪狂犬疫苗对犬存在安全问题，亟待进一步改进，降低其毒力。US3 基因 为疱疹病毒的另一重要的毒力基因，对调控细胞凋亡和和调节宿主免疫反应等也起到关键的作 用。本研究应用CRISPR/Cas9 技术以rPRVdelUS7/US8/UL23 为亲本株构建US7/US8/UL23/US3 四基因 缺失毒株，并评价rPRVdelUS7/US8/UL23 和US7/US8/UL23/US3 四基因缺失的重组PRV 毒株对犬的致 病性，以探究其对犬的安全性，从而为伪狂犬的防控提供安全有效的疫苗。 本研究首先将PRV US3 基因克隆至原核表达载体，进行原核表达后免疫小鼠制备US3 抗体 血清。然后采用CRISPR/Cas9 方法，设计靶向US3 基因一对sgRNAs，并将其克隆至表达载体后 与rPRVdelUS7/US8/UL23 基因组进行共转染；48 h 后即可看见典型细胞病变（Cytopathic effect ，CPE ）， 72h 后收获转染细胞上清液，接种PK- 15 细胞，进行蚀斑纯化筛选；经过 10 轮的纯化后通过PCR 和Western-blot 进行鉴定正确后，将获得的病毒命名为rPRVdelUS7/US8/UL23/US3 。rPRVdelUS7/US8/UL23/US3 病毒遗传稳定，未见缺失回复突变。通过复制动力学试验及细胞病变试验对rPRVdelUS7/US8/UL23/US3 生长能力进行评价，结果表明，与野生型和 rPRVdelUS7/US8/UL23 相比，rPRVdelUS7/US8/UL23/US3 病毒滴 度较低，但仍具有良好的复制能力，且感染细胞后未见细胞融合现象发生；通过攻毒后对犬的临 床观察、病理变化和组织病毒载量进行致病性分析，结果表明，2×104 TCID50 攻毒剂量下， rPRVdelUS7/US8/UL23 对犬致死，而 rPRVdelUS7/US8/UL23/US3 攻毒后，犬体温正常，临床症状不明显，病 理变化不典型，组织病毒载量降低，不致死，表明 PRVdelUS7/US8/UL23/US3 的致病性相比野生型和 rPRVdelUS7/US8/UL23 明显减弱。本研究首次揭示了US3 基因是PRV 疫苗株感染犬后的毒力基因，为 PRV 疫苗进一步改进提供了理论基础。 关键词：PRV ，CRISPR/Cas9，重组病毒，致病性 I Abstract Pseudorabies (PR) is an acute infectious disease caused by pseudorabies virus (PRV). Pigs are the main nature host of PRV, immunization with attenuated vaccines is one of the effective ways to prevent and control pseudorabies. The US7/US8-deleted and US7/US8/UL23-deleted attenuated vaccines have been widely used in the prevention and control