介导猪瘟病毒侵入的功能性受体CRISPR_Cas9筛选平台的建立.pdfVIP

摘 要 猪瘟 （Classical swine fever, CSF ）是由猪瘟病毒（CSF virus, CSFV ）引起的一种给世界养猪 业造成重大经济损失的烈性传染病。该病毒没有自身代谢机构及酶系统，必须依赖于宿主细胞完 成自己的复制周期，其复制始于病毒粒子与细胞受体的特定相互作用。CSFV 表面蛋白与细胞受 体之间的相互作用决定了其组织嗜性和宿主范围。更重要的是，可以将阻断病毒-受体相互作用从 而阻止病毒侵入作为抗病毒策略。因此，研究细胞受体不仅有助于了解病毒的侵入机制，并且可 为开发新的抗病毒制剂提供精准靶标。 研究表明，在CSFV 侵入过程中，层粘连蛋白受体（Laminin receptor, LamR ）作为病毒的吸 附受体；CD46 分子参与吸附过程；硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS ）作为细胞适应毒的吸附 受体。然而，在一些CSFV 非易感细胞中也有LamR 、CD46 和HS 的表达，表明尚有介导CSFV 侵入的功能性受体未被发现。因此，需要构建相关技术平台筛选介导 CSFV 侵入的功能性受体。 之前的筛选方法基本都是以蛋白质相互作用为主，如病毒铺覆蛋白印迹技术等，而如今新兴的 RNA 干扰法（RNA interference, RNAi ）、单倍体细胞遗传筛选、CRISPR/Cas9 筛选技术已经成为 生物技术领域筛选病毒细胞受体的重要工具。相较于前两者，CRISPR/Cas9 技术筛选条件极其严 格，Cas9 核酸酶会靶向基因组DNA ，使其产生永久性损伤，极大地降低了假阳性结果，筛选得 到的都是调控病毒感染的关键宿主因子。本研究利用猪源细胞膜蛋白的 sgRNAs 文库构建基于 CRISPR/Cas9 技术的筛选平台，并评估其筛选效果，以期为筛选介导CSFV 侵入的功能性受体奠 定基础。 本研究中，首先利用反向遗传操作系统构建了稳定表达 Venus 荧光蛋白的重组 CSFV （rCSFV-Venus ），并优化了重组病毒的培养条件；又利用慢病毒系统构建了稳定表达 Cas9 蛋白 的PK-15 细胞系，采用Western blotting 和流式细胞术等试验筛选出Cas9 蛋白表达量高、切割活 性强的6#-PK-Cas9 单克隆细胞株；通过分析猪源及人源膜蛋白基因的跨膜区筛选了3 500 个猪源 细胞膜蛋白基因，并针对每一个膜蛋白基因设计3 条sgRNAs，将sgRNAs 克隆至慢病毒载体后 包装成慢病毒，构建猪源细胞膜蛋白sgRNAs 慢病毒文库，将慢病毒文库转导至PK-15 细胞中检 测sgRNAs 慢病毒文库的感染效率。结果显示，本研究获得了10 500 个sgRNAs 慢病毒，且每个 sgRNA 慢病毒都能够感染细胞，表明sgRNAs 慢病毒文库具有筛选介导CSFV 侵入的功能性受体 的可用性及有效性；将sgRNAs 慢病毒文库以MOI = 0.3 的剂量转导至6#-PK-Cas9 单克隆细胞株， 利用嘌呤霉素加压培养后感染rCSFV-Venus ，利用流式分选系统分选出未感染病毒的细胞，提取 其基因组、PCR 扩增sgRNAs 序列后经高通量测序来评估CRISPR/Cas9 筛选平台的筛选效果。结 果显示，我们筛选到 12 个得分较高且定位于细胞膜上的候选基因。表明本研究构建的 CRISPR/Cas9 筛选平台可用于筛选介导猪瘟病毒侵入的功能性受体。 总之，本研究利用稳定表达Cas9 蛋白的PK-15 细胞、猪源细胞膜蛋白sgRNAs 慢病毒文库 及稳定表达Venus 荧光蛋白的重组CSFV 构建了CRISPR/Cas9 筛选平台，可用于筛选并鉴定介导 CSFV 侵入的功能性受体，对阐明CSFV 致病机制、发现新型抗病毒靶标、研发新型疫苗和制定 新的抗病毒策略具有重要的意义，而且所建立的筛选平台可用于筛选其他猪源病毒的功能性受体。 关键词：猪瘟病毒，重组病毒，CRISPR/Cas9 技术，功能性受体 I Abstract Classical swine fever (CSF) is a fatal disease caused by classical swine fever virus